植物乳桿菌LV02 抑菌特性及發酵培養基優化研究

楊 悅，滑婉月，陳志迪，張 瑤，易欣欣，高秀芝

（食品質量安全北京實驗室/農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室/微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室/北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206）

0 引 言

【研究意義】植物乳桿菌屬于革蘭氏陽性桿菌，兼性厭氧[1]。在人體的胃腸道內，植物乳桿菌屬于優勢菌群，可以通過代謝產生有機酸及細菌素等有益物質，有效抑制腐敗菌[2]。乳酸菌素是具有類似抗生素的殺菌功效，但不會產生抗藥性及毒性的多肽或蛋白質[3?4]。大部分乳酸菌素只有效抑制G+或G?，而均具有抗菌效果的則較少[5]。菌株產抗菌物質能力的大小與菌株特性有很大關系。有研究表明發酵培養基中的營養成分也對菌株所產抗菌物質的抑菌能力有所影響[6]。另外，乳酸菌素在食品中應用廣泛，為使之發揮最大作用，了解抑菌活性的適宜pH 環境及溫度也十分重要[7]。因此，開展植物乳桿菌發酵培養基的優化及其抑菌特性的研究，對替代抗生素類防腐劑的開發具有重要意義。【前人研究進展】近年來，為研究植物乳桿菌抑菌特性及生物量OD600的優化，學者們進行了大量探索[8]。王瑤等[9?10]研究的植物乳桿菌LPL-1 對單增李斯特氏菌具有抑制作用。優化培養基發現，葡萄糖對發酵產物影響最大，優化后細菌素可提高1.62 倍；在100 ℃，30 min 條件下LPL-1 的細菌素仍具有熱穩定性；徐瓏倩等[11]研究的植物乳桿菌P158 對藤黃微球菌、銅綠假單胞桿菌具有抑制作用。在對培養基的氮源及吐溫80 成分進行優化后，細菌素明顯提高了218%。Zhao 等[12]研究植物乳桿菌素JLA-9 的生化特性時，發現該乳桿菌素具有耐高溫的特性。而許女等[13]對植物乳桿菌素KF1 進行pH 2.0～12.0 處理時發現，只有pH 為2.0～6.0 時該乳桿菌素具有較好的抑菌性，中性及堿性環境便失去了抑菌活性。Yoo 等[14]研究優化植物乳桿菌JNU 2116 的發酵培養基，發現酵母提取物對其生長影響最大。【本研究切入點】目前的研究成果中，對于可同時抑制G+及G?的植物乳桿菌報道較少。植物乳桿菌LV02 可抑制部分革蘭氏陽性及陰性菌[15]。對大腸桿菌YS 有一定的抑菌效果，大腸桿菌YS 分離于生菜，為植物乳桿菌LV02后續開發抗菌保鮮類產品提供技術參考。采用響應面法優化發酵培養基，可以克服正交法篩選范圍寬泛的缺點，經爬坡與最陡爬坡試驗對水平范圍進行縮減，使最終結果更具說服力[16]。【擬解決的關鍵問題】植物乳桿菌LV02 分離于發酵蔬菜，前期發現其可抑制部分革蘭氏陰性及陽性菌[15]。本研究以植物乳桿菌LV02 為研究對象，對其抑菌特性進行探討。并基于單因素、爬坡試驗及最陡爬坡試驗，以抑菌圈直徑及生物量OD600為響應值，利用CCD 試驗進行數據分析，通過優化植物乳桿菌LV02 的發酵培養基，提高對大腸桿菌YS 的抑菌性及生物量OD600，以期為植物乳桿菌LV02 的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與主要試劑

植物乳桿菌LV02（Lactobacillus plantarum，NCBI登錄號：MH885507），分離源于發酵蔬菜；大腸桿菌YS（Escherichia coli，NCBI 登錄號：MN153456.1），分離源于生菜。以上菌種均保存于北京農學院食品學院菌種保藏室。營養瓊脂（nutrient agar，NA）、營養肉湯（nutrient broth，NB）、酵母浸粉，酪蛋白胨均購于北京陸橋技術股份有限公司；葡萄糖及蔗糖均購于國藥集團化學試劑有限公司。MRS 肉湯（MRS）：葡萄糖20 g·L?1、蛋白胨10 g·L?1、牛肉粉5 g·L?1、酵母菌4 g·L?1、乙酸鈉5 g·L?1、磷酸氫二鉀2 g·L?1、硫酸鎂0.2 g·L?1、檸檬酸三銨2 g·L?1、硫酸錳0.05 g·L?1、吐溫80 1 mL·L?1、蒸 餾水1 L。pH6.2 ± 0.1，121 ℃高壓滅菌15 min 備用。

1.2 主要儀器設備

WS-01 型恒溫恒濕箱，湖北黃石恒豐醫療器械有限公司；BSA2202S 型分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；DL-CJ-1N 型超級潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；MLS-3750 型高壓蒸汽滅菌鍋，Sanyo ELectric Co.Ltd；T6 型新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌LV02 發酵上清濾液的制備 從植物乳桿菌LV02 的甘油保藏管中以2%的接種量置于10 mL 的MRS 液體培養基中，37 ℃靜置培養12 h。蘸取一環菌液進行兩代平板劃線，每代培養24 h，得到二代活化板。從中挑取2 環單菌落轉接到50 mL的MRS 液體培養基中37 ℃靜置培養12 h，再用同樣的溫度以5%的接種量轉培靜置24 h，得到LV02發酵培養液。4 ℃，15 min，8 000 r·min?1離心，再用0.22 μm 的無菌濾膜過濾，得到LV02 發酵上清過濾液。

1.3.2 指示菌的培養 從經二代活化的大腸桿菌YS 平板上挑取一環單菌落，置于已高壓滅菌的LB肉湯中進行12 h、150 r·min?1、37 ℃的恒溫培養。

1.3.3 抑菌試驗 向60 ℃左右的150 mL 營養瓊脂內注入107CFU·mL?1的大腸桿菌菌液150 μL，在超凈臺上左右混勻，倒入一次性平板內。瓊脂凝固后，放上牛津杯，向每個牛津杯內注入100 μL 的LV02 發酵上清過濾液，三組平行，37 ℃培養12 h觀察抑菌圈直徑。

1.3.4 植物乳桿菌LV02 抑菌特性

1.3.4.1 硫酸銨沉淀法初步分離LV02 的細菌素 取LV02 發酵上清過濾液，分別以40%、50%、60%、70%、80%及90%的飽和度硫酸銨進行12 h 沉淀。將硫酸銨沉淀液進行15 min、8 000 r·min?1的4 ℃低溫離心，將得到的離心沉淀，用去離子水（體積為發酵上清液的1/10）進行混勻復溶。采用0.22 μm 的無菌濾膜過濾復溶液，采用牛津杯法，篩選硫酸沉淀LV02 的細菌素最佳飽和度。

1.3.4.2 植物乳桿菌LV02 熱穩定性試驗 將pH 6.3 的LV02 發酵上清濾液，分別置于60 、80、100 ℃的恒溫水浴鍋中處理60、90 、120 min。經0.22 μm 的無菌濾膜過濾后進行牛津杯試驗。

1.3.4.3 pH 對植物乳桿菌 LV02 抑菌活性的影響用1 mol·L?1的NaOH 溶液及鹽酸將LV02 發酵上清濾液的pH 分別調至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。以未經處理的LV02 發酵上清濾液作為對照，采用牛津杯法觀察對大腸桿菌YS 的抑制效果。

1.3.4.4 植物乳桿菌LV02 對不同指示菌的抑菌效果取5%的LV02 種子液，轉置MRS 肉湯培養24 h，得到LV02 發酵培養液。以4 ℃，15 min，8 000 r·min?1離心，再用0.22 μm 的無菌濾膜過濾，得到LV02 發酵上清過濾液。向60 ℃左右的150 mL 營養瓊脂內分別注入107CFU·mL?1的大腸桿菌YS、單增李斯特菌及豬霍亂沙門氏菌150 μL。在超凈臺上左右混勻，倒入一次性平板內。瓊脂凝固后，放上牛津杯，在每個牛津杯內放入100 μL 的LV02 發酵上清過濾液，每次重復3 次，37 ℃培養12 h 觀察抑菌圈直徑。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 優化氮源、碳源 以MRS 肉湯配方為 基礎，將氮源（19 g·L?1）等量替換為大豆蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、蛋白胨及酵母浸粉+蛋白胨（1∶1）。確定氮源后，再將碳源（20 g·L?1）等量替換為葡萄糖、蔗糖、果糖、D-果糖、乳糖、葡萄糖+乳糖（1∶1）及葡萄糖+蔗糖（1∶1），其他成分及含量和MRS 肉湯一致，用50 mL 去離子水攪拌加熱溶解，121 ℃、15 min 高壓滅菌。以體積分數為5%的量進行發酵接種，37 ℃培養24 h，以牛津杯法測定抑菌圈直徑，選出最佳碳源。

1.3.5.2 優化礦物質組合 固定氮源、碳源，對礦物質進行優化。組合因子有磷酸氫二鉀（0、2、4、6、8 g·L?1）、硫酸鎂（0、0.1、0.2、0.3、0.4 g·L?1）、乙酸鈉（0、2.5、5.0、7.5、10 g·L?1）及硫酸錳（0、0.1、0.2、0.3、0.4 g·L?1）。首先選取其中一種考察因子，按照所設計的不同添加量來逐一篩選。其他因子以此類推。最終得到一組無機鹽組合，其他成分及含量和MRS 肉湯一致，用50 mL 去離子水攪拌加熱溶解，121 ℃高壓滅菌15 min。以體積分數為5%的量進行發酵接種，37 ℃培養24 h，以牛津杯法[17]測定抑菌圈直徑，選出最佳礦物質組合。

1.3.5.3 優化吐溫80、生長因子組合 以0、1、2、3、4 mL·L?1對吐溫80 進行單因素篩選。確定吐溫80 添加量后，分別加入胡蘿卜汁、黃瓜汁、西紅柿汁、胡蘿卜汁+西紅柿汁（1∶1）、黃瓜汁+西紅柿汁（1∶1），各50 mL·L?1。其他成分及含量和MRS 肉湯一致。用50 mL 去離子水攪拌加熱溶解，采用121 ℃、15 min 高壓滅菌。以體積分數為5%的量發酵接種，37 ℃培養24 h 后取出，以牛津杯法測定抑菌圈直徑，選出最佳生長因子。

1.3.6 爬坡試驗 在單因素試驗結果的基礎上，采用PB 試驗初步設計出每個因子的高低水平（高低水平的差值要適合，否則會出現效應不明顯的結果）。對葡萄糖、酵母浸粉、硫酸錳、硫酸鎂、乙酸鈉、吐溫80 及胡蘿卜汁，這7 種因子進行PB 試驗（n=12）。以抑菌圈直徑為響應值，分析影響LV02抑菌效果的顯著影響因子，Plackett-Burman 設計因子水平見表1。

1.3.7 最陡爬坡試驗根據PB 試驗結果中的排列圖，可確定因子的步長及方向[18]，正效應則添加量以最低水平往上增加步長，負效應則將添加量以最高水平往下減步長[16]。取對LV02 抑菌影響貢獻率最高的前三種因子，其余因子添加量則以單因素結果為準，進行最陡爬坡試驗得到CCD 試驗中心點。

1.3.8 CCD 試驗 將最陡爬坡試驗結果作為CCD 試驗的中心點，其他非關鍵因子固定，以抑菌圈直徑及OD600作為響應值，進行3 因子5 水平的CCD 優化試驗[19]。CCD 優化試驗對考察因子設定的水平范圍大，可使預期值和實際結果更相符。試驗因子與水平設計見表2。

表 1 Plackett-Burman 設計因子水平及編碼Table 1 Factors, levels, and codes of Plackett-Burman experimental design

2 結果與分析

2.1 不同飽和度硫酸銨溶液的細菌素測定

不同飽和度硫酸銨溶液的細菌素測定結果見圖1，所有考察的飽和濃度經沉淀后，其復溶液均有抑菌效果。其中在硫酸銨溶液飽和度為80%時，抑菌圈直徑可達到最大，為15.50 ± 0.50 mm，證明80%飽和度的硫酸銨沉淀植物乳桿菌LV02 的細菌素能力明顯優于其他飽和度（P＜0.05）。

表 2 CCD 試驗各因子水平數Table 2 Levels for each factor on CCD experiment

圖 1 不同飽和度的硫酸銨溶液沉淀細菌素的效果Fig. 1 Effect of saturation degree of ammonium sulfate solution on bacteriocin precipitation

圖 2 熱處理對植物乳桿菌LV02 抑菌效果的影響Fig. 2 Effect of heat treatment on bacteriostatic property of LV02 bacteriocin

2.2 植物乳桿菌LV02 熱穩定性試驗

植物乳桿菌LV02 熱穩定性試驗結果見圖2，pH 6.3 的LV02 發酵上清濾液經不同溫度、時間處理后抗菌活性逐漸降低。在處理60 min 內，LV02 對3 種溫度不敏感，結果之間差異不顯著（P＞0.05）。而在這之后，開始呈現明顯的下降趨勢。直到處理90 min，3 條溫度線出現平緩態，LV02 的抗菌活性處于穩定狀態。60 ℃處理60 min，抑菌結果比初始值高，這可能是有該溫度處理下使抑菌物質得到分解產生了活性肽[20]。100 ℃處理120 min，抑菌圈直徑為14.30 ± 0.14 mm，保留了約80%的抑菌活性，說明植物乳桿菌LV02 對高溫不敏感，可以在高溫環境內保持活性。

2.3 pH 對LV02 抗菌活性的影響

pH 對LV02 抗菌活性的影響結果見圖3，植物乳桿菌LV02 在pH 為 3.0～7.5 均具有抗菌活性。pH 為3.0 時抗菌活性最強，抗菌圈直徑為21.58 ± 0.34 mm。pH 3.0～6.0 時，LV02 的抑菌活性是緩慢下降的趨勢，直到pH 在6.0 以上時，抗菌活性下降的幅度開始增大，且pH 6.0、6.5、7.0、7.5 之間差異顯著（P＜0.05），pH 為7.0 時保留了近80%的抗菌活性，說明LV02 在酸性及中性環境下pH 穩定性較好。這與姜晶等[21]在研究植物乳桿菌DMS20174 對pH 的耐受情況相似，并指出這可能與大腸桿菌在該環境下競爭性不強有關。

圖 3 不同pH 對植物乳桿菌LV02 抑菌性的影響Fig. 3 Antibacterial effect of LV02 bacteriocin under pH in large intestines

2.4 LV02 對3 種指示菌的抑菌情況

植物乳桿菌LV02 對不同指示菌的抑菌效果如表3所示。LV02 對大腸桿菌YS、單增李斯特氏菌以及豬霍亂沙門氏菌這3 種指示菌均具有抑制作用。其中，對豬霍亂沙門氏菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑可達到24.74 ± 0.51 mm。其次是單增李斯特氏菌、大腸桿菌。雖然從3 種指示菌比較來看，大腸桿菌對LV02 所產抑菌物質的敏感度不高，但是從先前研究人員在植物乳桿菌對大腸桿菌抑菌作用方面的研究結果來看[22]，抑菌圈直徑僅為5～10 mm，與LV02 抑制大腸桿菌的作用結果差異顯著。并且與對革蘭氏陰性菌沒有殺菌效果的同科菌株（Nisin）相比，LV02 具有明顯的優勢[23]。因此，LV02 植物乳桿菌可對部分革蘭氏陰性及陽性菌產生抑制作用，未來可將其應用于抑菌產品類開發。

表 3 LV02 對3 種指示菌的抑菌結果Table 3 Antibacterial results of LV02 against three kinds of ndicator bacteria

圖 4 不同氮源對LV02 的細菌素抗菌性的影響Fig. 4 Effect of culture nitrogen sources on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

2.5 單因素優化結果

2.5.1 氮源、碳源的優化 氮源的優化結果如圖4 所示，不同氮源對植物乳桿菌LV02 的細菌素抗菌性均具有顯著性影響（P＜0.05），可被LV02 所利用。在以酵母浸粉為唯一氮源時，細菌素抗菌性最好，抑菌圈直徑可達24.25 ± 0.29 mm。添加蛋白胨時，抗菌性最低，抑菌圈直徑僅為15.75 ± 0.50 mm。將蛋白胨與酵母浸粉1∶1 添加，抗菌效果也次于單一氮源酵母浸粉（P＜0.05），與大豆蛋白胨之間差異不顯著（P＜0.05），本試驗與章檢明[24]在優化Lactobacillus plantarumLac-B23 發酵培養基氮源時的結論一致，其以蛋白胨作為氮源時細菌素效價僅為40 AU·mL?1，而氮源為酵母浸粉時效價則為560 AU·mL?1。故本試驗以酵母浸粉作為LV02 優化培養基的最佳氮源。不同碳源對LV02 的細菌素抗菌性的作用效果如圖5可知，葡萄糖的影響作用最大，抑菌圈直徑可達24.28 ± 0.32 mm，與其他碳源相比具有顯著性影響（P＜0.05）。其次為果糖、葡萄糖+蔗糖（1∶1）。D-果糖、乳糖、蔗糖及葡萄糖+蔗糖（1∶1）之間差異不顯著（P＞0.05）。不同碳源的結構是不同的。蔗糖及乳糖屬于雙糖，果糖及D-果糖雖為單糖，但也需要分解才能被利用，因此利用率偏低。生物對糖類物質的攝入，主要以葡萄糖的形式進行吸收[25]。故本試驗以葡萄糖為LV02 優化培養基的最佳碳源。

圖 5 不同碳源對LV02 的細菌素抗菌性的影響Fig. 5 Effect of culture carbon sources on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

2.5.2 礦物質組合的優化 物質優化的結果見圖6～9。圖6 中，K2HPO4質量濃度為2 g·L?1時，對LV02的細菌素抗菌影響最大，與未添加效果相比差異顯著（P＜0.05）。而低于或高于此質量濃度時對抗菌效果均有影響，故以2 g·L?1作為K2HPO4的添加量。乙酸鈉的質量濃度為5 g·L?1時（圖7），對LV02 抑菌效果最好，與未添加相比兩者具有顯著差異（P＜0.05）。質量濃度為5 、10 g·L?1時，兩者差異不顯著（P＞0.05），但考慮成本，故選5 g·L?1作為乙酸鈉的添加量。圖8 中，隨著硫酸鎂質量濃度的增加，抑菌圈直徑呈現先增大后降低的趨勢，質量濃度為0.2 g·L?1時，對大腸桿菌YS 的抗菌效果最佳。高玉榮等[26]研究結果表明向植物乳桿菌G1-28 發酵培養基中添加0.3%的硫酸鎂時活菌數可達到最高，低于或高于此劑量都會使活菌數的優化不利。故以0.2 g·L?1進行硫酸鎂的添加。由圖9 可知，硫酸錳對LV02 的抑菌效果影響較大，與其他各處理組差異明顯（P＜0.05），隨著質量濃度的增加抑菌圈直徑呈現先增大后降低的趨勢。0.2 g·L?1時抗菌效果最佳，抑菌圈直徑為23.50 ± 0.50 mm，與其他各處理量呈顯著性差異（P＜0.05）。王帥[27]研究影響植物乳桿菌L69 發酵液OD 值的影響因子時，發現硫酸錳相較硫酸鎂及吐溫80，對L69 的OD 值具有顯著影響。因此本實驗對硫酸錳以0.2 g·L?1進行添加。

圖 6 磷酸氫二鉀對LV02 的細菌素抗菌效果的影響Fig. 6 Effect of dipotassium hydrogen phosphate in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

圖 7 乙酸鈉對LV02 的細菌素抑菌效果的影響Fig. 7 Effect of sodium acetate in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

圖 8 硫酸鎂對LV02 的細菌素抗菌效果的影響Fig. 8 Effect of magnesium sulfate in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

2.5.3 吐溫 80、生長因子的優化 吐溫 80 的優化結果見圖10，不同含量的吐溫80 對LV02 的細菌素抗菌作用影響不同。在1 mL·L?1時，LV02 的細菌素抗菌效果最佳。而在此含量以上添加量越大會出現抗菌效果下降的趨勢。因此以1 ml·L?1作為吐溫80 的添加量。生長因子的優化結果如圖11，5 種生長因子均可提高LV02 的細菌素抗菌能力，其中胡蘿卜汁所作用的抗菌效果最佳（P＜0.05），其次為西紅柿汁、黃瓜汁。這可能是3 種蔬菜均含有大量B 族維生素及多種礦物質[27?28]，而胡蘿卜還含有胡蘿卜素及多種維生素，可刺激LV02 的菌體產出更多的細菌素，增強抑菌效果。而這些是黃瓜和西紅柿所不可替代的，故以50 mL·L?1的胡蘿卜汁作為單一生長因子進行添加。

圖 9 硫酸錳對LV02 的細菌素抗菌效果的影響Fig. 9 Effect of manganese sulfate in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

圖 10 吐溫對LV02 的細菌素抗菌效果的影響Fig. 10 Effect of Tween-80 in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

圖 11 不同生長因子對LV02 細菌素抗菌效果的影響Fig. 11 Effect of growth factors in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

2.6 爬坡試驗結果

Plackett-Burman 試驗結果及各因子貢獻率及效應值見表4、5。表5 中，葡萄糖（X1）、硫酸錳（X7）及酵母浸粉（X2）這3 種因子對LV02 抑菌能力的貢獻率最高其中葡萄糖可達到41.39%。其次為硫酸錳、酵母浸粉，分別為19.61%和15.41%。根據各組分的效應值結果可知，葡萄糖為正效應，設計最陡爬坡試驗的取值范圍應以低水平往上增。酵母浸粉與硫酸錳為負效應，取值應以高水平往下減。3 種組分相對于其他4 種具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，以葡萄糖、酵母浸粉及硫酸錳進行最陡爬坡試驗，其余因素按照單因素結果比例進行添加。

2.7 最陡爬坡試驗結果

最陡爬坡試驗的設計方案及結果見表6。5 組試驗中，4 號試驗組的抑菌圈直徑最大。故將4 號試驗組，即葡萄糖（35.00g·L?1）、硫酸錳（0.16 g·L?1）及酵母浸粉（18.00 g·L?1），作為CCD 試驗中心點。

2.7.1 CCD 試驗結果 采用Design Expert 12 做方程擬合與顯著性分析，CCD 試驗設計及結果見表7。得到了植物乳桿菌LV02 抑制桿菌LV02 抑制大腸桿菌YS 的抑菌圈直徑及OD600相對于葡萄糖（X1）、硫酸錳（X7）及酵母桿菌LV02 抑制大腸桿菌YS 的抑菌圈直徑及OD600相對于葡萄糖（X1）、硫酸錳（X7）及酵母浸粉（X2）的回歸方程：

表 4 Plackett-Burman 試驗結果Table 4 Results of Plackett-Burman experiment

表 5 各因子貢獻率及效應值Table 5 Contribution rates and effect values of individual factors

表 6 最陡爬坡試驗結果Table 6 Results of steepest ascent experiment

對Y抑菌圈直徑及YOD600這2 個回歸方程進行方差分析，由表8，9 可知，模型均為P＜0.0001，說明模型均可行且可達到極顯著水平（P＜0.01）。2 組模型的失擬項均P＞0.05，說明實驗結果與模型高度匹配。另外，2 組模型的R2分別為0.9263 和0.9408，均＞0.9，說明2 組模型能夠分別反應LV02 的細菌素抑菌圈直徑及OD600與葡萄糖、硫酸錳及酵母浸粉之間的關系，可描述90%以上的試驗值。2 組模型的R2

abj分別86.01%與88.76%，表明培養基配方對抑菌圈直徑和OD600的影響達到了85%以上。變異系數（C·V）均＜5%，表明該模型的重現性高。并且由Prob 值分析可知，Y抑菌圈直徑模型中二次項X12、為極顯著，X22為顯著，一次項及交互項均不顯著。YOD600模型中交互項X1X2為顯著，說明葡萄糖與酵母浸粉對OD600菌體量有促進作用。X12、X72及為極顯著，其余一次項及交互項均為不顯著。2 組回歸方程中的二次項系數均為負值，說明該方程具有最大值。另外根據Y抑菌圈直徑及YOD600的方差分析結果，得到影響LV02 的細菌素抗菌能力及OD600的因素大小順序為：X1＞X2＞X7，即葡萄糖＞酵母浸粉＞硫酸錳。

表 7 中心組合設計及結果Table 7 CCD design and response values

影響因子葡萄糖、硫酸錳及酵母浸粉兩兩與響應值抑菌圈直徑及OD600之間的響應曲面圖及等高線結果如圖12～15 所示。圖12（a）及圖13（i）反映了酵母浸粉不變的條件下，硫酸錳和葡萄糖對抑菌圈直徑的交互影響。葡萄糖的質量濃度為27 ～35 g·L?1內抑菌圈直徑有所提高，隨后出現降低。等高線圖形近圓形，說明硫酸錳和葡萄糖之間的交互影響較顯著。圖12（b）及圖13（h）可以看出，在葡萄糖質量濃度不變的情況下，隨著硫酸錳的增加、酵母浸粉的降低，抑菌圈直徑呈上升趨勢。當硫酸錳達到0.16 g·L?1左右、葡萄糖降低至16 g·L?1之后抑菌圈直徑呈減小趨勢。硫酸錳的響應面坡度比酵母浸粉的坡度大，說明硫酸錳對抑菌圈直徑的影響較大。等高線呈現橢圓形，表明酵母浸粉和硫酸錳之間交互作用明顯。從圖12（c）及圖13（d）可知，在硫酸錳一定的條件下隨著葡萄糖的增加與酵母浸粉的降低，抑菌圈直徑呈上升趨勢。當葡萄糖添加量達到35 g·L?1時，酵母浸粉降至18 g·L?1之后抑菌圈直徑逐漸降低。等高線呈橢圓形，表明酵母浸粉和葡萄糖之間的交互作用顯著。圖14、圖15中關于酵母浸粉、硫酸錳及葡萄糖之間與OD600的作用效果與抑菌圈直徑的結果相同。

2.7.2 驗 證 試 驗 結 果 為 了 驗 證CCD 模 型 的 可 靠性，以葡萄糖34.07 g·L?1、硫酸錳0.16 g·L?1、酵母浸粉18.12 g·L?1，其他因素固定不變，進行3 次驗證試驗。如表10 所示，抑菌圈直徑實際值為24.50 ± 0.31 mm，預測值為24.58 mm，與預測值相差近0.022%；OD600實際值為2.877 ± 0.23，預測值為2.877，與預測值相差近0.023%。表明2 個擬合方程優化結果可靠性大。同時，優化后的兩種響應值相比未優化前分別提高了近26%與12%，說明試驗所確定的優化方式合理有效，LV02 的抑菌能力及OD600的增加程度達到了預期目的。

表 8 以抑菌圈直徑為響應值的回歸方程方差分析Table 8 Analysis of variance for regression model based on bacteriostatic zone diameter as response value

表 9 以OD600 為響應值的回歸方程方差分析Table 9 Analysis of variance for regression model based on OD600 as response value

圖 12 葡萄糖、硫酸錳和酵母浸粉兩兩交互影響LV02 抑菌圈直徑的曲面圖Fig. 12 Curved view on effects of glucose, manganese sulfate, and yeast extract in medium on LV02 inhibition zone diameter

圖 13 葡萄糖、硫酸錳和酵母浸粉兩兩交互影響LV02 抑菌圈直徑的等高線圖Fig. 13 Contour lines on effects of glucose, manganese sulfate, and yeast extract in medium on LV02 inhibition zone diameter

圖 14 葡萄糖、硫酸錳和酵母浸粉兩兩交互影響LV02 OD600 的曲面圖Fig. 14 Curved view on effects of glucose, manganese sulfate, and yeast extract in medium on LV02 OD600

圖 15 葡萄糖、硫酸錳和酵母浸粉兩兩交互影響LV02 OD600 的等高線圖Fig. 15 Contour lines on effects of glucose, manganese sulfate, and yeast extract in medium on LV02 OD600

表 10 LV02 發酵培養基驗證試驗結果Table 10 Verification of LV02 fermentation medium

3 討論與結論

植物乳桿菌LV02 發酵培養基對其抑菌能力及OD600有著重要影響，這決定著LV02 對腐敗菌的抗菌效果與活菌數。有研究表明，經優化后的發酵培養基可明顯提高抗菌能力，細菌素是原先的1.62倍[9]，具有較高的研究與利用價值。研究者曾發現酵母提取物對植物乳桿菌的生物量影響最大[14]。本研究選用以大腸桿菌YS 為指示菌，抑菌圈直徑及生物量OD600為評價指標。在單因素試驗的基礎上，采用PB 試驗及最陡爬坡試驗使影響因子的步長及方向接近最大產值，確定CCD 試驗中心點。采用CCD設計試驗，確定關鍵影響因子的最佳水平。并通過牛津杯法研究LV02 的抑菌特性，來確定LV02 對溫度及pH 的穩定性。試驗結果顯示，酵母浸粉、葡萄糖及硫酸錳這3 種因子對LV02 發酵培養基抑菌功效影響較大，這與章檢明[24]、王莉[25]和王帥[26]等的研究結果一致，可能是酵母浸粉中含有利于抗菌物質合成的氨基酸、生長因子；葡萄糖是最基礎的單糖，可以使植物乳桿菌LV02 得到直接的碳源吸收；而硫酸錳可能是其Mn2+可促進合成植物乳桿菌LV02 的抗菌物質；PB 試驗結果表明，胡蘿卜汁可促進植物乳桿菌LV02 分泌抑菌物質，但其不屬于關鍵因子，優化后的培養基配方中除了胡蘿卜汁用量無變化之外，其余多種組分含量有變更，分析可能不同培養基成分之間存在相互作用[16,29]，降低了胡蘿卜汁的正效應。

pH 在偏酸性環境下更利于發揮LV02 的抑菌性，可能是在該環境下更有利于LV02 抑菌物質的合成；LV02 在100 ℃處理120 min 后可保留抗菌活性，可能是LV02 菌株自身可耐高溫；LV02 可以抑制大腸桿菌YS，可能是其產生的細菌素可以抑制大腸桿菌形成生物膜[30]。本文最終得到LV02 發酵培養基的優化配方為：葡萄糖34.07 g·L?1、酵母浸粉18.12 g·L?1、磷酸氫二鉀2 g·L?1、硫酸錳0.16 g·L?1、乙酸鈉5 g·L?1、硫酸鎂0.2 g·L?1、檸檬酸銨1 g·L?1、吐溫80 1 mL·L?1、胡蘿卜汁50 mL·L?1，蒸餾水1 L。用該配方培養LV02，使對大腸桿菌YS 的抑菌圈直徑比未優化前提高了近26%，OD600提高了12%，說明優化方式合理有效。通過抑菌特性分析，確定了粗提植物乳桿菌LV02 的細菌素所需硫酸銨飽和度為80%，證明了植物乳桿菌LV02 具有熱穩定性（100 ℃，120 min）、酸堿穩定性（pH 3.0～7.5）與抑菌性。本試驗可為植物乳桿菌LV02 開發抗菌保鮮類產品提供技術參考。