高粱病程相關基因非表達子1(NPR1)基因家族鑒定及脅迫應答分析

杜巧麗 方遠鵬 蔣君梅 孫 濤 任明見 謝 鑫

(1貴州大學農(nóng)學院農(nóng)業(yè)微生物特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2國家小麥改良中心貴州分中心，貴州 貴陽 550025；3重慶海關技術中心，重慶 400020)

病程相關基因非表達子1 (non-expressor of pathogenesis related genes1，NPR1)是在研究系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)[1]信號傳導途徑時從擬南芥突變體中發(fā)現(xiàn)的，并以其突變體npr1 的表型命名[2-5]。NPR1 含有典型的多個錨蛋白重復序列Ankyrin 和1 個BTB/POZ 區(qū)，其結(jié)構(gòu)域與蛋白-蛋白互作緊密相關[6-7]。NPR1 的表達在植物免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，它是植物水楊酸(salicylic acid，SA)信號通路的重要組分之一。在擬南芥中，SA 可直接與NPR1 的同源蛋白NPR3 和NPR4 結(jié)合，并調(diào)節(jié)其與NPR1 的相互作用，影響NPR1 蛋白的穩(wěn)定性[2，6，8]；同時SA 也能激活植物的防御基因(如病程相關蛋白基因PR)，從而產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，以保護植物免受病原菌的侵染[9]。在低溫條件下，擬南芥細胞質(zhì)中的NPR1 會轉(zhuǎn)入細胞核，促使NPR1 與熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(recombinant heat shock transcription factor 1，HSFA1)相互作用，介導植物產(chǎn)生適應低溫的調(diào)節(jié)途徑，此時NPR1 可作為調(diào)節(jié)寒冷和接收病原體信號的中心樞紐，從而保證植物能更好地適應環(huán)境變化[10]，說明NPR1 能響應逆境脅迫。

NPR1 同源基因廣泛存在于植物中，現(xiàn)已作為抗病相關基因而被研究，并在擬南芥(Arabidopsis thaliana)[11]、小麥(Triticum aestivum)[12]、水稻(Oryza sativa)[13-14]、玉米(Zea mays)[15-16]、大麥(Hordeum vulgare)[17]、 楊 樹(Populus)[18]和甘蔗(Saccharum officinarum)[19]等物種中均有報道，而在高粱[Sorghum bicolor(L.) Moench]中鮮見相關研究報道。

高粱屬禾本科單子葉植物，是一種典型的旱糧經(jīng)濟作物，種植面積廣泛。與其他禾谷類作物相比，高粱具有較強的生長力，兼具較強的耐鹽堿性、抗旱性、耐高溫等抗逆特性[20-21]。高粱為C4光合作用植物，具有光合效率高，生物產(chǎn)量高等特點，享有“沙漠中的駱駝”稱號[22-23]。據(jù)報道，在水稻[13]、玉米[16]、大麥[17]、甘蔗[19]和油菜[24]等多種植物中，過表達NPR1 基因可有效提高植物對白葉枯病、粗縮病、赤霉病、黑穗病、菌核病等病害的抗性，說明NPR1 基因在植物抗病過程中起著重要作用。因此，本研究從全基因組水平出發(fā)，對高粱NPR1 家族成員進行鑒定，通過系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，基因結(jié)構(gòu)分析和染色體定位等生物信息學方法研究其基本特征，并通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)方法檢測SbNPR1 基因在不同組織、不同激素以及病原相關分子模式(pathogenassociated molecular pattern receptors，PAMPs)脅迫條件下的相對表達量，旨在為進一步探究該家族基因在調(diào)節(jié)高粱響應植物激素以及病原菌脅迫應答反應方面提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 高粱品種及處理方法 本研究所用高粱品種BTx623 由貴州大學植物病理教研室保存。高粱種子經(jīng)表面消毒后，在滅菌水中浸種24 h，之后用紗布保濕培養(yǎng)72 h 進行催芽，將發(fā)芽的種子種植于滅菌營養(yǎng)土中，在25℃溫室中進行晝夜交替培養(yǎng)，待長到三葉期，用獨腳金內(nèi)酯(strigolactone，GR24，1 μmol·L-1)、 SA(1 mmol·L-1)、氯化鈉(NaCl，250 mmol·L-1)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG6000，20%)、甘露醇(Dmannitol，300 mmol·L-1)、flg22(100 nmol·L-1)和幾丁質(zhì)(Chitin，8 nmol·L-1)處理，分別在0、0.5、1、3、6、9、12 和24 h 取樣，設置3 個生物學重復，每個重復處理5 株苗，將所取樣品立即用液氮進行速凍，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 本試驗中所用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于普洛麥格(北京)生物技術有限公司，RT-qPCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。試驗所用激素，鹽脅迫和干旱脅迫處理劑均購自北京酷來搏科技有限公司。flg22 購自南京金斯瑞生物科技有限公司，Chitin 購自圣克魯斯生物技術(上海)有限公司。

1.1.3 引物設計 高粱SbNPR1 基因的RT-qPCR 正向引物為SbNPR1-qF:5′-ACCAATATTCTTCCCTTCCCA A-3′，反向引物為SbNPR1-qR:5′-AACAATGTGGGAAG TATCGTCT-3′。高粱內(nèi)參基因SbEIF4a的RT-qPCR 正向引物為SbEIF4a-qF:5′-AGGATTGGCACCAGAAGGG T-3′，反向引物為SbEIF4a-qR: 5′-CACATCAAGCCCCT TGCAGA-3′。以上引物均由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。

1.2 高粱SbNPR1 基因家族鑒定、亞細胞定位、染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析

通過Hmmer 3.0 軟件以擬南芥、水稻建立的序列徽標檢索高粱數(shù)據(jù)庫(Phytozome)，基于SMART 和NCBI-CD 網(wǎng)站檢測保守結(jié)構(gòu)域；SbNPR1 家族蛋白的基本理化性質(zhì)用ExPASy-ProtParam tool 預測；蛋白亞細胞定位利用網(wǎng)站http:/ /www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/進行；染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析分別在網(wǎng)站 http:/ /mg2c. iask. in/mg2c _ v2.0/及http:/ /gsds.cbi.pku.edu.cn/進行。

擬南芥NPR1 基因家族的序列均源于擬南芥數(shù)據(jù)庫(https:/ /www.arabidopsis.org)，甘蔗、水稻、玉米、高粱NPR1 基因家族的序列分別來源于(https:/ /sugarcane-genome. cirad. fr/)、 MSU ( http:/ /rice.plantbiology.msu.edu/)和Phytozome 數(shù)據(jù)庫。

1.3 高粱SbNPR1 基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹及蛋白保守功能基序分析

利用MEGA 7.0 軟件，以鄰接法(neighbor-joining，NJ；bootstrap ＝1 000)構(gòu)建NPR1 基因家族系統(tǒng)發(fā)育進化樹，使用Evolview 對所構(gòu)建的進化樹進行美化，蛋白保守功能基序分析通過MEME 軟件進行。

1.4 高粱SbNPR1 基因表達分析

以高粱植株cDNA 為模板，通過RT-qPCR 檢測SbNPR1 基因的表達量，擴增體系為:cDNA 4.5 μL，SYBR Premix 7.5 μL，上下游引物各0.3 μL，滅菌去離子水補至15 μL。反應程序:95℃預變性10 min，95℃變性15 s，55℃復性15 s，72℃延伸20 s，40 個循環(huán)，熒光定量數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt方法進行分析，并利用SPSS 軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱SbNPR1 基因家族鑒定

運用Hmmer 程序依據(jù)擬南芥和水稻的NPR1 家族全蛋白序列構(gòu)建Hmmer 模型，檢索高粱數(shù)據(jù)庫獲得E 值≤1×10-5的序列，利用SMART 及NCBI-CDD 數(shù)據(jù)庫驗證其保守結(jié)構(gòu)域，保留含有BTB/POZ 區(qū)和Ankyrin 錨蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，去除冗余序列。共鑒定到5 個NPR1 成員，分別命名為SbNPR1～SbNPR5(表1)。其中SbNPR5 編碼的氨基酸序列最短(480 aa)，SbNPR2 編碼的氨基酸序列最長(621 aa)；該家族分子量介于50.496 81～67.648 06 kDa；理論等電點介于5.64～6.11 之間，表明這5 個成員基因編碼的蛋白呈弱酸性；利用MG2C 網(wǎng)站對高粱的NPR1 基因家族成員進行染色體定位分析，發(fā)現(xiàn)3 號染色體上分布3個基因，分別是SbNPR1、SbNPR2 和SbNPR3；5 號染色體上分布1 個基因，為SbNPR4 基因；8 號染色體分布一個基因，為SbNPR5 基因；亞細胞定位預測顯示，該家族基因分別位于細胞核和細胞質(zhì)(表1)。

表1 SbNPR1 基因家族編碼蛋白的基本特征Table 1 Basic characteristics of the putative proteins encoded by SbNPR1 gene family

2.2 NPR1 基因家族系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 7.0 將高粱NPR1 家族蛋白序列與擬南芥、水稻、玉米及甘蔗的NPR1 家族蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建，如圖1 所示。高粱中NPR1 基因家族成員在3 個分支中均有分布，在第Ⅰ分支中高粱SbNPR2 與AtNPR3、AtNPR4 及OsNPR3、ZmNPR1等蛋白聚在一支，推測SbNPR2 可能參與對SAR 的負調(diào)控[25]； 在 第Ⅱ分支中包括 SbNPR1、 AtNPR1、AtNPR2、Sh253P03、Sh203L02 及OsNPR1 等成員，其中SbNPR1 與Sh253P03、Sh203L02 親緣關系最近，其次是Zm00008a010809，且OsNPR1 已證實在提高植株抗病性中起著重要作用[13]，因此推測SbNPR1、Sh253P03、Sh203L02 及Zm00008a010809 可能參與對SAR 的正調(diào)控；在第Ⅲ分支中，包括高粱3 個成員SbNPR3、SbNPR4 及SbNPR5。從整體來看NPR1 基因在進化過程中相對保守。

2.3 高粱NPR1 基因家族結(jié)構(gòu)分析

通過GSDS 軟件繪制高粱NPR1 基因家族的內(nèi)含子-外顯子基因結(jié)構(gòu)圖，如圖2 所示。該家族基因內(nèi)含子數(shù)目為2 ～4 個，其中SbNPR1、SbNPR2 均被3 個內(nèi)含子分割為4 個片段；SbNPR3、SbNPR4 和SbNPR5均被1 個內(nèi)含子分割為2 個片段。此外，該基因家族都具有編碼和非編碼兩個區(qū)域，其中SbNPR3、SbNPR4和SbNPR5 這3 個基因均含有2 個編碼區(qū)，而SbNPR1、SbNPR2 含有4 個編碼區(qū)。

2.4 高粱NPR1 基因家族蛋白保守motif 分析及多序列比對分析

為了對高粱SbNPR1 家族蛋白保守motif 進行探究，利用MEME 軟件預測了10 個保守motif。由圖3可知，motif 1、motif 2、motif 3、motif 4、motif 5、motif 6 為所有成員都具有的保守基序，而motif 8、motif 9 僅出現(xiàn)在SbNPR3、SbNPR4 和SbNPR5 中，motif 10 出現(xiàn)在SbNPR4 和SbNPR5 中；另外，motif 8、9 和10 僅存在于SbNPR4 和SbNPR5 中，推測這些基因可能具有某些特殊功能。

將NPR1 與其他物種中的同源氨基酸序列進行比對，并使用SMART 網(wǎng)站分析NPR1 氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)所有成員都含有NPR1 基因所具有的典型結(jié)構(gòu)域，BTB/POZ 結(jié)構(gòu)域、ANK-repeat 錨蛋白重復序列結(jié)構(gòu)域以及NPR1_like_C-terminal 結(jié)構(gòu)域，且NPR1_like_C-terminal結(jié)構(gòu)域包含核定位信號NLS 位點，該位點與其在核內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關[9]。利用DNAMAN 進行多序列比對，結(jié)果表明，多序列同源性比對結(jié)果為62.82%；各個結(jié)構(gòu)域之間的同源性分別為:BTB/POZ 結(jié)構(gòu)域62.60%、ANK-repeat 錨蛋白重復序列結(jié)構(gòu)域67.59%、NPR1_like_C-terminal 結(jié)構(gòu)域70.02%(圖4)。

圖1 NPR1 基因家族進化分析Fig.1 Evolutionary analysis of NPR1 gene family

圖2 SbNPR1 基因家族成員的結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Gene structure analysis of SbNPR1 gene family

2.5 SbNPR1 基因表達分析

系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，在5 個高粱NPR1 基因中，由于SbNPR1 基因與水稻OsNPR1 位于同一分支，親緣關系較近(圖1)，且OsNPR1 已被證明為SA 的受體基因，因此本研究選取SbNPR1 基因進行進一步的表達分析。

圖3 SbNPR1 基因家族保守基序分析Fig.3 Conserved motif analysis of SbNPR1 gene family

2.5.1SbNPR1 基因組織表達特征 對高粱不同組織SbNPR1 基因的表達進行分析，發(fā)現(xiàn)其在不同的組織器官中表達不同，具有組織特異性，其在葉中的表達量顯著高于根、莖和芽，葉中的相對表達量約是根的10.4 倍(圖5)。

2.5.2SbNPR1 基因響應激素表達分析SbNPR1 在GR24 和SA 不同作用時間下的表達模式分析結(jié)果表明，SbNPR1 的表達量隨著GR24 處理時間的延長而顯著降低，SbNPR1 表達量受到了一定程度的抑制(圖6-A)。但SA 處理3 h 時SbNPR1 表達量達到最大值，約為對照組的4.4 倍，說明SA 誘導了SbNPR1 的表達(圖6-B)。

2.5.3SbNPR1 基因響應干旱及鹽脅迫表達分析 用PEG6000、D-mannitol、NaCl 模擬干旱及鹽脅迫，分析SbNPR1 基因表達。結(jié)果表明，經(jīng)PEG6000 處理0.5 h時，SbNPR1 的表達顯著上調(diào)且達到最大值，之后迅速降低(圖7-A)；經(jīng)甘露醇處理后，SbNPR1 的表達呈先升后降的模式，其相對表達量在3 h 時達到最大值(圖7-B)；在NaCl 處理下，SbNPR1 的表達在0.5 h 時顯著上調(diào)并達到最大值，之后下降(圖7-C)。以上結(jié)果說明SbNPR1 可能是高粱響應干旱及鹽脅迫的一個功能基因。

2.5.4SbNPR1 基因響應病原相關分子模式(PAMPs)表達分析 為檢測PAMPs 激發(fā)子flg22 和Chitin 是否影響SbNPR1 的表達量，分別用flg22 和Chitin 處理高粱，發(fā)現(xiàn)經(jīng)flg22 處理后，SbNPR1 的表達量在12 h 時表達量顯著升高并達到最大值(圖8-A)。相反，經(jīng)Chitin 處理后SbNPR1 的表達量從處理后6 h開始受到抑制(圖8-B)。上述結(jié)果表明flg22 和Chitin分別激活和抑制SbNPR1 基因的表達，暗示SbNPR1 參與不同的植物先天免疫應答過程。

3 討論

植物在生長發(fā)育過程中會受到一些病原物(如細菌、真菌、病毒等)的侵染，但植物自身也存在能夠抵御病原物侵染的免疫應答反應。NPR1 基因在植物的抗病過程中起著核心調(diào)控作用，它能提高植物抵御多種病原物侵害的能力，是植物體內(nèi)多種抗病通路途徑之間的一個交叉位點[26]。已有報道表明，AtNPR1 基因的組成性表達能誘導水稻產(chǎn)生抗病性[27]，同時在擬南芥、水稻和西紅柿中過表達NPR1 基因，能提高對細菌和真菌的抗性[19]，表明在植物防御系統(tǒng)中NPR1 起著極其重要的作用；當NPR1 在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過量表達時，能提高擬南芥對逆境脅迫的抗性[28]；并且在沒有病原體侵染的時候，也能對基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)節(jié)[29]。因此，對高粱NPR1 基因家族進行鑒定和分析對于提高高粱抗性具有重要意義。

圖4 SbNPR1 與其他物種的同源氨基酸序列比對Fig.4 Amino acids alignment between SbNPR1 and other species

圖5 SbNPR1 基因的組織特異性表達Fig.5 Tissue specific expression of SbNPR1 gene

基因表達分析表明，經(jīng)過SA 處理后的高粱，其表達量呈現(xiàn)出先升后降的模式，在處理3 h 時，NPR1 表達量顯著升高并達到最大值，之后顯著降低，說明SA會影響NPR1 基因在植株內(nèi)的表達，這與玉米[16]、甘蔗[19]、梨[30]、小麥[31]、草地早熟禾[32]、蘋果[33]、花生[34]等物種中報道的結(jié)果相似。在擬南芥中，NPR1在SA 存在的情況下，能通過RNA 聚合酶Ⅱ聚集類似CDK8、WRKY18 和TGA等轉(zhuǎn)錄因子，從而促進靶基因和自身的表達啟動植物免疫信號[35]；在無SA 的情況下，NPR1 主要是以胞質(zhì)形式而存在，而當植物受到病原侵染時，SA 的累積會促使NPR1 轉(zhuǎn)移到細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TGA相互作用，啟動靶基因的表達[36]。研究報道，超表達NPR1 基因可提高植物的抗病性。如在甘 蔗[19]、 芥 菜[37]、 棉 花[38]、 小 麥[39]、 花 生[40]、 蘋果[41]、胡蘿卜[42]、番茄[43]和水稻[13]中過表達NPR1可分別提高對黑穗病、黑斑病菌、黑腐病、赤霉病、黃曲霉、白粉病、細菌性葉斑病、番茄花葉病毒和稻瘟病的抗性。

本研究顯示，外源SA 處理3 h 時，高粱SbNPR1基因的相對表達量顯著升高，說明SA 能影響SbNPR1基因在植株內(nèi)的表達，但是否SbNPR1 基因的表達能提高高粱抗逆性還需進行基因功能學證實。高粱SbNPR1 基因的表達具有組織特異性，在葉中的相對表達量最高，根中最少，這與NPR1 基因在甘蔗組織中表達具有相似性[19]，但在花生中，NPR1 主要在根和葉中表達，在莖中表達量較少[44]，而擬南芥AtNPR1、水稻OsNPR1 均無組織特異性表達[45]，由此推測NPR1在不同物種中其組織表達具有差異性。

圖6 SbNPR1 基因的激素響應表達Fig.6 Expression of SbNPR1 under hormone treatments

圖7 SbNPR1 基因的干旱及鹽脅迫表達Fig.7 Expression of SbNPR1 gene under drought and salt stress

圖8 SbNPR1 基因響應PAMPs 表達分析Fig.8 Expression analysis of SbNPR1 gene under PAMPs treatments

通過PEG6000、甘露醇、NaCl 模擬逆境脅迫處理條件下的基因表達特征，發(fā)現(xiàn)SbNPR1 基因在逆境脅迫中，在處理較短時間內(nèi)表達量顯著下降，這與蘋果MpNPR1-2 在干旱脅迫下較長時間內(nèi)處理才會下降的基因有所不同，在持續(xù)兩周的干旱脅迫結(jié)束時，根系中的MpNPR1-2 基因的表達量顯著升高[46]，因此在SbNPR1 在根系中是否出現(xiàn)此情況還有待進一步研究。研究表明，病原體相關分子模式(pathogenassociated molecular pattern receptors，PAMPs)不僅能激活蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPKs)途徑，而且還能誘導植物引發(fā)防御信號途徑[47]，本研究通過檢測PAMPs 激發(fā)子flg22 和Chitin對SbNPR1 基因表達量的影響，發(fā)現(xiàn)flg22 能快速觸發(fā)SbNPR1 基因的表達，而Chitin 則相反，抑制了SbNPR1基因的表達。擬南芥幼苗在經(jīng)過flg22 處理后，也能誘導NPR1 快速表達[48]，與本研究flg22 試驗結(jié)果具有一致性，說明PAMPs 激發(fā)子flg22 在調(diào)控SbNPR1 基因的表達過程中起作用。本研究對高粱SbNPR1 基因的表達分析為今后進一步研究NPR1 基因的功能奠定了基礎。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學方法從高粱數(shù)據(jù)庫共鑒定到5 個高粱NPR1 家族成員，該家族成員均含有一個BTB/POZ 結(jié)構(gòu)域和一個或多個Ankyrin 錨蛋白結(jié)構(gòu)域，所編碼的蛋白序列長度介于480 ～621 aa 之間，所預測的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量介于50 ～67 kDa 之間，其理論等電點為5.64 ～6.11。RT-qPCR 結(jié)果表明，SbNPR1基因的表達具有組織特異性，且受到植物激素、干旱和PAMPs 脅迫的影響。本研究為進一步揭示NPR1 家族基因的生物學功能，及其在調(diào)節(jié)高粱抗性和響應植物激素等過程中的作用提供了基礎。