農抗211對水稻紋枯病菌細胞膜和抗氧化酶活性的影響

魏麗梅 鄒小文 徐婷璐 袁文濤 魏賽金

(江西農業大學應用微生物研究所，江西 南昌 330045)

水稻紋枯病是由擔子類立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染水稻引起的重要真菌病害之一[1]。近年來，由于氮肥使用量增加以及田間土壤中菌核數量增多，導致水稻紋枯病廣泛傳播[2]。目前，化學農藥是水稻紋枯病菌的有效防治方法，然而高劑量農藥殘留，不僅會增加植物病害抗性，而且危害環境，威脅人類健康。隨著合成農藥的開發和回收成本不斷上升，人們更愿意選擇以生物方式開發、價格更低廉且環境友好型的防治產品。生物防治能夠利用微生物及其所產活性物質來防治植物病害，開發天然生物產品對農業生產、環境保護、人體健康具有重要意義[3]。

研究表明，放線菌會產生大量具有復雜結構和豐富活性的次級代謝產物，是產活性物質最多的一類生防菌。鏈霉菌屬(streptomyces)及其相關類群被認為是主要的放線菌屬，廣泛用于植物病害生物防治[4-5]。鏈霉菌能夠產生多種抗生素、酶抑制劑、植物激素等活性物質，對提高植物的抗病、抗逆性能具有重要作用[6-8]。如 Harikrishnan 等[9]獲得的鏈霉菌VSMGT1014 的乙酸乙酯提取物具有抑制真菌菌絲生長、孢子和菌核萌發的作用。王巖等[10]發現鏈霉菌菌株F-1 對水稻紋枯病菌有顯著的拮抗作用，其代謝產物導致水稻紋枯病菌頂端菌絲彎曲，菌絲體皺縮畸形。于冰等[11]研究表明淀粉酶產色鏈霉菌的胞外代謝產物豐加霉素對黃瓜立枯絲核菌的菌絲生長和菌核形成均有明顯的拮抗作用。生防鏈霉菌產生的活性物質能夠造成病原菌體氧化，導致細胞內物質大量外滲、細胞原生質體失活，達到抑制病原微生物的作用[12]。目前鏈霉菌產活性物質作用于真菌細胞膜和菌體抗氧化系統的研究相對較少，鏈霉菌應用于植物病害防治上的研究也鮮有報道。

鏈霉菌JD211 是本研究前期分離得到的一株產灰褐色孢子的鏈霉菌，經鑒定為奈良鏈霉菌(Streptomyces naraensis)，產環己酰亞胺類物質，命名為農抗211，可顯著抑制水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、煙草黑脛病菌、根霉等多種植物病原真菌的生長[13]。李張[14]發現，0.99 μg·mL-1的農抗211 能夠促進水稻種子萌發，而62 μg·mL-1的農抗211 則能夠提高水稻結實率，增加產量，并且能誘導水稻對紋枯病產生抗性，調控水稻葉片相關抗性酶活和抗逆性物質含量，從而減少紋枯病對水稻的侵害。邵正英等[15]發現將鏈霉菌JD211 菌劑施入水稻根際土壤后，能有效增加水稻抗性，抑制病原菌的進一步侵染，有效提高水稻對稻瘟病的抗性。雖然關于農抗211 在水稻抗病、促生方面的研究較多，但其對病原真菌抑菌的作用機理尚不明確。本試驗通過農抗211 作用水稻紋枯病菌菌絲，旨在明確其對病菌細胞膜及其抗性酶活的影響，為應用鏈霉菌JD211防治水稻真菌病害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株:鏈霉菌JD211(StreptomycesJD211)，由江西農業大學生物科學與工程學院實訓基地實驗室提供；水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)，由江西省農業科學院植物保護研究所惠贈。

農抗211 的制備:參照李張[14]的方法。稱取適量的固體菌劑與蒸餾水以質量體積比1 ∶1浸提24 h，8 000 r·min-1離心，上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌得到無菌的農抗211，通過與納他霉素對水稻紋枯病的對抗試驗，可得到農抗211 相應效價濃度為15.8 μg·mL-1，4℃保存備用。

1.2 培養基

馬鈴薯蔗糖培養基(potato sucrose agar，PSA):去皮土豆200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。馬鈴薯蔗糖培養液(potato sucrose broth，PSB)培養基:不含瓊脂的PSA 培養基。米飯固體培養基:早秈米500 g，葡萄糖5 g，麩皮20 g；先將大米浸泡16 ～24 h，蒸煮成米飯，加入適量葡萄糖均勻拌在米飯中，加入麩皮，加水混勻輕搓，裝入蘑菇瓶(500 mL 菌種組培玻璃瓶)中，121℃高壓滅菌1 h，備用。

1.3 方法

1.3.1 熒光顯微鏡觀察細胞膜通透性 采用Φ 6.0 mm 打孔器打取PSA 平板上的水稻紋枯病菌菌塊，接種于50 mL PSB 培養液中，于28℃、160 r·min-1振蕩培養至對數生長期后，處理組加入備用的農抗211 藥液使其終濃度為4.00 μg·mL-1，以等量無菌水為對照(CK)。培養24 h 后取少量菌體加入pH 值7.2 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗數次，每次3 min。用70%乙醇4℃下固定菌絲1 h，再用PBS 漂洗3 次，每次3 min。除去PBS 后，加入0.5 mL 50 μg·mL-1的熒光染料碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液，4℃避光20 min。用PBS 沖洗多余的染液。置熒光顯微鏡于綠光激發波長465 ～495 nm 下觀察。每個重復試驗中取2 個平行進行觀察[16]。

1.3.2 對水稻紋枯病菌胞外電導率的影響 將紋枯病菌接種于PSA 培養基上，28℃培養2 d，用打孔器打取6 塊菌絲塊，接種于50 mL PSB 培養液中，于28℃、160 r·min-1振蕩培養2 d，取出菌絲，用滅菌蒸餾水反復沖洗并抽干水分。稱取2 g 洗凈的菌絲放入三角瓶中，加入濃度分別為0、0.46、4.00 μg·mL-1的農抗211藥液，每處理設置一個藥劑對照(CK)，即只含各濃度農抗211 而不加菌絲，置于28℃、160 r·min-1搖床培養，分別于0、2、4、6、8 h 測定電導率。每處理試驗重復3 次。

1.3.3 丙二醛含量測定 Φ 6.0 mm 打孔器打取PSA平板上的水稻紋枯病菌菌塊，接種于50 mL PSB 培養液中，于28℃、160 r·min-1恒溫搖床培養至對數生長期，處理組加入不同濃度的農抗211 無菌藥液使其終濃度為0.63、1.26、2.53、5.06 μg·mL-1，以等量無菌水為對照(CK)，培養48 h，無菌蒸餾水沖掉菌絲上的培養基，用濾紙吸干水分。稱取1 g 菌絲，加入2 mL 10%的三氯乙酸，研缽中研磨成勻漿，然后轉移至離心管中，再用4 mL 10%的三氯乙酸沖洗研缽，重復2 次，合并提取液。10 000 r·min-1離心15 min 收集上清液。采用硫代巴比妥酸法[17]測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.4 總脂質含量測定 采用磷香草醛法測定不同處理下水稻紋枯病菌總脂質含量[18]，菌絲培養及處理方法同1.3.3。分別稱取0.5 g 干燥菌絲在液氮下進行研磨；加入4 mL 甲醇∶氯仿∶水(2 ∶1 ∶0.8，v ∶v ∶v)，劇烈震蕩后靜置40 min。取出較低相位(下層)含有脂質的混合液與0.2 mL 生理鹽水(0.9%)混合，4℃、4 000 r·min-1條件下離心10 min，取0.8 mL 提取液加入到0.2 mL 氯仿和0.2 mL 濃硫酸中，沸水中加熱10 min，室溫下冷卻。向各提取液中分別加入5 mL 磷光體香草醛素，室溫下保持10 min。最后用紫外分光光度計在520 nm 波長處測定顯色染料的吸光度值。用膽固醇做標準曲線測定總脂質含量。每個處理3 次重復，取均值。

1.3.5 抗氧化酶活性測定 菌絲培養及處理方法同1.3.3，稱取1 g 菌絲，加入5 mL 預冷的0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液 [2%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)，pH 值7.8]及少量石英砂冰浴研磨成勻漿。4℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液用磷酸緩沖液定量至10 mL 即為粗酶液，用于酶活性測定，水稻紋枯病菌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)和多酚氧化酶(ployphe-noloxidase，PPO) 活性測定參考文獻[19-21]；取0.2 g 菌絲置于研缽中，加10 mL 預冷的0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 值7.0)，于冰上充分研磨后，4℃、10 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液用于水稻紋枯病菌脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性測定，測定方法參考文獻[22]；取0.5 g 菌絲，加入2 mL 預冷的0.05 mol·L-1硼酸緩沖液[含5 mmol·L-1巰基乙醇，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和1% PVP，pH 值8.8]及少量石英砂于預冷的研缽中，冰浴下研磨成漿，4℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，上清液即為粗酶液，用緩沖液定量至5 mL，用于苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)活性測定[23]。以上處理測定時均以添加等量相應緩沖液為空白對照用于調零，每組試驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 農抗211 對水稻紋枯病菌絲體表面形態及細胞膜通透性的影響

熒光染料PI 是一種能夠對DNA 進行染色的細胞核染色試劑[16]，可通過破損細胞或者死亡細胞的細胞膜，與核酸結合染色，熒光顯微鏡下顯現紅色熒光。對照組菌絲基本未見熒光；藥液處理組菌絲呈現較強的紅色熒光。表明經農抗211 處理后，水稻紋枯病菌細胞膜被破壞，通透性增加，PI 染料進入細胞，核酸被染色，細胞膜通透性的改變引起細胞內容物泄露，影響水稻紋枯病菌的正常生長(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡下菌絲熒光Fig.1 Visualization of hyphae under fluorescence microscopy

2.2 農抗211 對水稻紋枯病菌胞外電導率的影響

由圖2 可知，處理2 h 時，0.46 和4.00 μg·mL-1藥液處理組胞外電導率分別為53.10、217.67 μs·cm-1，顯著高于對照(2.53 μs·cm-1)(P＜0.05)，處理10 h 時，0.46 和4.00 μg·mL-1藥液處理組胞外電導率達到最高值，分別為56.43、234.90 μs·cm-1，比處理2 h 分別增加了6.27%和12.96%，隨著藥液濃度的增加，水稻紋枯病菌胞外電導率也增加，說明農抗211 可作用于水稻紋枯病菌菌絲細胞膜，破壞細胞膜的穩定性。

圖2 不同濃度農抗211 對水稻紋枯病菌胞外電導率的影響Fig.2 Effect of different concentration of antifungalmycin 211 on extracellular conductivity of R. solani

2.3 農抗211 對水稻紋枯病菌MDA 含量的影響

MDA 是膜脂質過氧化反應的終產物，是膜脂質過氧化的一個重要指標。藥液處理組菌絲MDA 含量隨著藥液處理濃度的增加而增加，且藥液濃度大于0.63 μg·mL-1時，與CK 相比，MDA 含量分別增加了26.63%、54.53%和102.34%，表明一定濃度農抗211能夠引起水稻紋枯菌絲發生膜脂質過氧化反應，破壞細胞膜，進而影響細胞凋亡(圖3-A)。

2.4 農抗211 對水稻紋枯病菌總脂質含量的影響

脂質是細胞膜的主要成分，具有調節細胞膜流動性和增加細胞膜穩定性的功能[24]。藥液處理組菌絲總脂質含量均比CK 低，總脂含量48.46 mg·g-1，經5.06 μg·mL-1藥液處理后的菌絲總脂質減少了20.84%?？傊|含量的降低表明脂質結構被破壞，細胞膜的穩定性降低，進一步影響了細胞膜的完整性(圖3-B)。

圖3 不同濃度農抗211 對水稻紋枯病菌丙二醛含量(A)和總脂質含量(B)的影響Fig.3 Effect of different concentration of antifungalmycin 211 on intracellular malondialdehyde content (A) and total lipids content (B) of R. solani

2.5 農抗211 對水稻紋枯病菌抗氧化酶活性的影響

由表1 可知，與CK 相比，藥液濃度為0.63 μg·mL-1時，SOD、CAT 和POD 活性升高；當藥液濃度大于0.63 μg·mL-1時，3 種酶活性均隨著濃度增加而降低；PPO 活性隨著藥液濃度增加呈現明顯下降趨勢；當藥液濃度為1.26 μg·mL-1時，PAL 活性明顯升高，PAL 和PPO 可維持菌體抗氧化能力。當藥液濃度大于1.26 μg·mL-1時，PAL 活性急劇下降，明顯受到抑制。藥液濃度達到5.06 μg·mL-1時，酶活性與CK相比均受到明顯抑制；LOX 活性隨著濃度的增大而增大。結果表明，低濃度的藥液處理能激活SOD、CAT和POD，高效清除生物體內的活性氧，提高抗氧化能力，同時CAT 活性也增強，催化分解菌體內過量的H2O2，減少氧化傷害，起到防御作用。藥液濃度達到5.06 μg·mL-1時，5 種抗氧化酶活性均受到明顯抑制，菌體抗氧化系統遭嚴重破壞，LOX 活性最強，表明膜脂過氧化程度最嚴重，菌體細胞過氧化嚴重引起代謝紊亂，細胞逐漸凋亡。

3 討論

目前關于生防菌產生的拮抗物質對植物病原真菌的作用機制的研究主要是影響真菌細胞壁合成，破壞細胞膜完整性，抑制生物大分子的合成，以及影響細胞能量代謝系統等[12]。細胞膜是抑菌物質抗菌的作用位點之一。本研究中，PI 染色試驗表明農抗211 對水稻紋枯病菌細胞膜通透性有影響，菌體細胞膜的透性被破壞，菌絲皺縮。菌體胞外電導率升高，離子外流，破壞了細胞膜的穩定性，胞質外流，菌絲生長受到抑制。這與前期鏈霉菌702 菌株抗真菌單體組分DZP8作用于水稻紋枯病菌細胞膜結果類似[24]。

表1 不同濃度農抗211 對水稻紋枯病菌胞內抗氧化酶活性的影響Table 1 Effect of different concentration of antifungalmycin JD211 on antioxidant enzyme activity of R. solani

本研究結果表明，隨著農抗211 作用濃度增加，細胞膜受到破壞，抗氧化系統被激發，SOD、POD 和CAT活性開始增強，用于緩解膜過氧化反應，保護細胞。SOD 和POD 能夠催化超氧化物陰離子自由基反應分解，從而減輕細胞的氧化損傷，提高抗氧化能力[25]。CAT 能夠催化細胞發生氧化還原反應所產生的H2O2分解，減少H2O2對細胞的毒害[26]。SOD、POD 和CAT作為抗氧化系統中的重要酶類，其活性在一定程度上能反映細胞的抗氧化能力。本研究發現當藥液濃度為5.06 μg·mL-1時，水稻紋枯病菌SOD、POD、CAT、PAL和PPO 防御酶的活性均較CK 顯著降低，LOX 活性顯著增強，表明抗氧化系統受到嚴重破壞。LOX 能夠參與自由基產生、通透性改變和膜脂質過氧化等過程[27]，其活性能夠反映膜脂質過氧化程度。PAL 是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶，參與酚類物質和黃酮類物質合成，是一種防御酶[28]；PPO 能轉化酚類化合物并氧化脫氫生成鄰苯醌[29]，鄰苯醌參與物質合成，保持菌體正常生理代謝。PAL 和PPO 在一定程度上也可以反映生物的抗氧化能力。抗氧化系統被激發過程中，細胞總脂質含量降低，MDA 含量不斷上升，膜脂質過氧化反應加劇，拮抗真菌效果明顯。

4 結論

本試驗研究了農抗211 對水稻紋枯病菌細胞膜的作用機制，發現農抗211 對水稻紋枯病菌有較好的抑制作用，其作用機制是有效破壞水稻紋枯病菌菌絲體細胞膜結構的完整性，增加細胞膜通透性，致使胞內物質外泄，脂質含量減少，嚴重破壞菌體抗氧化系統，從而導致水稻紋枯病菌的菌絲體生長被抑制甚至死亡，從而達到抑制真菌病害的作用。本研究結果為鏈霉菌JD211 的生物防治應用提供了理論依據。