液氮凍結軟殼青蟹在凍藏期間的營養物質變化

郭麗萍 張麗敏 母昌考 葉央芳 王春琳

(寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211)

水產品因營養豐富和含水率高而高度易腐變質，直接影響消費需求和產品貨架期。防止水產品腐敗，維持其新鮮度是水產品質量安全的重要保障[1-2]。軟殼蟹是我國沿海重要的水產品，經蟹類蛻殼后形成，具有肉質細嫩、味道鮮美、方便食用和高鈣低脂等特性[3]。在我國，擬穴青蟹(Scylla paramamosain)常被加工成軟殼蟹，軟殼蟹除少部分用于鮮食外，大部分被冷凍保藏。低溫冷凍是保藏水產品的一種常用方法，但低溫下仍有腐敗菌和酶類的作用，導致水產品在冷藏過程中腐敗變質[4]。凍結保鮮是將擬凍藏的水產品中心溫度降低到冰點以下的一種保鮮技術[5-6]。液氮(liquid nitrogen，LN)凍結是一種常用的食品凍結保鮮技術[7-8]，已被成功應用于三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)[9]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[10-11]和鳙魚糜[12]的冷凍保藏，能顯著提高水產品在凍藏期間的品質，有效減緩揮發性鹽基氮和菌落總數的增加，維持肌肉組織的質構特性，防止蛋白質變性。因此，LN 凍結可能是一種延長軟殼蟹凍藏期的有效方法。

目前，水產品的質量和新鮮度評價已不再局限于主觀的感官評價和片面的物質分析，而傾向于與質量相關物質的全局定性和定量分析[13]。其中，基于高分辨核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)的代謝組學技術是食品質量評價的有力方法，被廣泛應用于食品研究領域[14-15]，不僅能揭示代謝圖譜與食品質量之間的相關性[16-17]，還能揭示食品質量指標[18-19]。在蟹類質量研究中，基于NMR 的代謝組學技術已應用于鑒別藍蟹(Callinectes sapidus)與石蟹(Eriphia verrucosa)和黃道蟹(Cancer pagurus)的代謝物組成差異[20]，以及檢測三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)發酵過程中小分子營養物質的組成變化[21]。因此，基于NMR 的代謝組學技術有助于了解LN 凍結對軟殼蟹在凍藏過程中的代謝譜變化，進而了解軟殼蟹的質量狀況。

本研究以擬穴青蟹軟殼蟹為材料，采用基于NMR的代謝組學技術評估LN 凍結對短期凍藏軟殼蟹肌肉和肝胰腺代謝譜的影響，并考察LN 凍結軟殼蟹在長期凍藏期間肌肉和肝胰腺代謝譜的變化，以期為軟殼蟹凍藏技術及其品質評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的擬穴青蟹硬殼蟹購自浙江寧波水產品批發市場，為獲得數量足夠的軟殼蟹，購買80 只雄性硬殼蟹，每只蟹重約250 g，分別單養在配備有循環水的蟹公寓中，鹽度控制在20‰～25‰。

甲醇、二水合磷酸二氫鈉和三水合磷酸氫二鉀(分析純)，上海國藥集團化學試劑有限公司；2，2，3，3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉[sodium 3-trimethylsilyl (2，2，3，3-d4) propionate，TSP]和重水(99.9%氘代)(色譜純)，美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 主要儀器與設備

Bruker Avance Ⅲ600 MHz 核磁共振譜儀，德國Bruker 公司；5415R 低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；TD-XBYM 組織破碎儀，北京同德創業科技有限公司；FreeZone 冷凍干燥機，美國Labconco 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 軟殼蟹的LN 凍結和凍藏處理 密切觀察擬穴青蟹蛻殼情況，選9 只剛蛻殼的青蟹作為新鮮軟殼蟹對照組(CK0)，把軟殼蟹置于冰水中麻醉3 min 后用于取樣。將18 只剛蛻殼的軟殼蟹在冰水中麻醉3 min，隨機選取9 只軟殼蟹直接單獨真空包裝，在-20℃條件下短期凍藏7 d，作為凍藏對照組(CK7)。余下9 只軟殼蟹經液氮(-196℃)冷凍3 min 后，分別單獨真空包裝，再置于-20℃凍藏7 d，作為LN 凍結組(LN)。再收集40 只剛蛻殼的軟殼蟹，置于冰水中麻醉3 min 后，用液氮速凍3 min，然后分別單獨真空包裝。把包裝后的軟殼蟹平均分成5 組，每組8 只。分別于-20℃凍藏0、2、4、6 和8 個月取肌肉(分別設為M1、M2、M3、M4 和M5 組)和肝胰腺(分別設為H1、H2、H3、H4 和H5 組)樣品用于NMR 分析。

1.3.2 軟殼蟹肌肉和肝胰腺組織的營養物質提取 所有凍藏軟殼蟹取樣后在常溫下自然解凍，稱取各軟殼蟹樣品的肌肉和肝胰腺組織各0.5 g 用于小分子營養物質提取，參考Chen 等[22]的提取方法。

1.4 NMR 分析

一維1H NMR 譜和二維NMR 譜的采集均在298 K下用核磁共振譜儀采集，試驗參數設置參見裴峰等[23]和婁永江等[24]的研究。

1.5 NMR 數據的多變量統計分析

在對樣品的1H NMR 譜進行分段積分時，選取所有樣品的譜區間為δ 9.20 ～0.80，并去除δ 5.2 ～4.8和δ 3.4～3.3 的信號區間以消除水和甲醇信號的干擾。再對每個積分區間的數據進行歸一化處理，并利用SIMCA-P＋軟件(V12.0，瑞典Umetrics 公司)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal projection to latent structure discriminant analysis，OPLS-DA)對歸一化的NMR 數據進行多變量數據分析，方法描述參見裴峰等[23]的研究。但由于本研究樣品重復數是9，因此，采用了8 倍交叉驗證和交叉驗證的方差分析(cross validation one-way analysis of variance，CV-ANOVA)[25]以評價OPLS-DA 模型的可靠性。同時采用回溯轉換方法[26]處理自動規格化的NMR 數據，用于構建相關系數圖。根據本研究樣品的重復數，確定某物質對兩組樣品區分具有顯著貢獻的相關系數(r)的截斷值為±0.632，即某一營養物質的｜r｜＞0.632 時，該物質對組間區分具有顯著貢獻(P＜0.05)。

為獲得由LN 凍結和凍藏所導致的軟殼蟹營養物質組成的差異，本研究計算了部分代謝物含量相對于對照的變化量，計算公式如下:(Cm-C0)/C0，其中，Cm表示營養物質在CK7、LN 或不同凍藏期軟殼蟹肌肉(M2、M3、M4 和M5)或肝胰腺(H2、H3、H4 和H5)中的濃度，而C0分別表示營養物質在CK0 或凍藏對照組肌肉(M1)或肝胰腺(H1)中的濃度。

2 結果與分析

2.1 軟殼蟹肌肉和肝胰腺提取物的NMR 分析

本研究共檢測了134 個樣品的一維1H NMR 譜，圖1 顯示了其中4 個典型的1H NMR 譜。根據同核和異核二維NMR 譜所提示的氫-氫之間和氫-碳之間的耦合關系，并參考文獻[21]的信息，共歸屬到34 種小分子有機物，包括15 種氨基酸(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)、5 種核苷類物質[肌苷、尿苷、尿苷三磷酸、腺苷單磷酸(adenosine monophosphate，AMP)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)]、4 種有機羧酸(乳酸、琥珀酸、?；撬岷脱雍魉?、3 種糖類(葡萄糖、海藻糖和麥芽糖)、2 種有機胺 類(組胺和二甲胺)、三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide，TMAO)、2 種有機堿類(甜菜堿和葫蘆巴堿)以及2-吡啶甲醇和一種未知物質U1，詳細的核磁信息見表1。盡管這兩種組織的小分子物質相似，但各組織含有特定的代謝物。如肌肉含有較豐富的腺苷單磷酸AMP 和ATP，而肝胰腺中的含量則低于NMR 檢測限。反之，肝胰腺含有較豐富的色氨酸、尿苷和尿苷三磷酸，而肌肉中的含量則低于檢測限。

圖1 軟殼蟹肌肉和肝胰腺提取物的代表性1H NMR 譜Fig.1 Representative1H NMR spectra of the muscle and hepatopancreas extracts of soft shell crabs

表1 軟殼蟹肌肉和肝胰腺提取物中的1H 和13C NMR 數據以及代謝物歸屬Table 1 1H and 13C NMR data and assignments of the metabolites in the muscle and hepatopancreas extracts of soft shell crabs

表1(續)

2.2 LN 凍結對短期凍藏軟殼蟹肌肉和肝胰腺小分子營養物質組成的影響

為揭示LN 凍結對凍藏軟殼蟹可能具有的保鮮作用，本研究首先采用主成分分析(principal component analysis，PCA)比較了LN 凍結對短期凍藏軟殼蟹肌肉和肝胰腺NMR 代謝譜的影響，發現第一和第二主成分(PC1 和PC2)構建的PCA 得分圖上，軟殼蟹肌肉和肝胰腺在這3 組(CK0、CK7 和LN)之間均無明顯區分(數據未列出)，表明凍藏和LN 凍結均未導致軟殼蟹代謝譜發生明顯變化，均具有較好的保鮮效果。但單變量分析顯示，CK7 和LN 組中仍有個別代謝物相對于CK0 產生了較大變化(圖2)，如肌肉中的二甲胺(dimethylamine，DMA)。CK7 肌肉的DMA 含量比CK0提高了2 倍；而經LN 凍結的軟殼蟹，7 d 凍藏后肌肉的DMA 含量與CK0 持平。與DMA 的變化類似，CK7組肝胰腺的肌苷含量比CK0 提高了1 倍；而經LN 凍結的軟殼蟹，7 d 凍藏后肝胰腺的肌苷含量仍維持CK0水平。除DMA 和肌苷外，其他小分子營養物質的變化大多在20%以下，僅肌肉中個別代謝物如纈氨酸、異亮氨酸和肌苷水平減少了30%～60%。

圖2 LN 凍結短期凍藏軟殼蟹肌肉和肝胰腺營養物質變化Fig.2 Relative changes of nutrients of soft-shell crab muscle and hepatopancreas after 7 d-frozen storage due to LN freezing

2.3 LN 凍結軟殼蟹在長期凍藏期間的營養物質組成變化

為進一步揭示LN 凍結對軟殼蟹長期凍藏的保鮮效果，本研究對不同凍藏期LN 凍結軟殼蟹可食組織提取物的NMR 數據進行了PCA 分析。結果顯示，組織差異是導致軟殼蟹樣品在PC1 和PC2 區分的主要原因，并在PC1 上發生了明顯區分；而凍藏時間是導致樣品區分的次要原因，其中肌肉樣品在PC1 上有隨凍藏時間變化的趨勢，而肝胰腺樣品的變化主要發生在PC2 上，且各組之間的區分不明顯。表明凍藏對肌肉營養物質組成產生了較大影響，但對肝胰腺的影響較小(圖3)。

圖3 長期凍藏過程中軟殼蟹肌肉和肝胰腺提取物的PCA 得分圖Fig.3 PCA scores plots of the extracts of muscle and hepatopancreas of soft shell crabs during long term frozen storage

為詳細了解凍藏過程中軟殼蟹肌肉和肝胰腺組織的物質組成變化，對不同凍藏期組織樣品的NMR 數據與凍藏前對照樣品進行了兩兩比較的OPLS-DA 分析，共構建了8 個OPLS-DA 模型，其中7 個模型具有較高的Q2值，且經CV-ANOVA 分析得到的P值小于0.05(圖4、5)，說明這7 個模型是具有可靠性的。由圖4 可知，與凍藏前的軟殼蟹肌肉相比，凍藏2 個月可導致肌肉中延胡索酸、ATP 和葫蘆巴堿水平顯著下降；凍藏4 個月可導致肌肉中甜菜堿、葡萄糖、麥芽糖和肌苷水平顯著升高，而甘氨酸、延胡索酸和ATP 水平顯著下降；凍藏6 個月可導致肌肉中甜菜堿、甘氨酸、葡萄糖、麥芽糖和肌苷水平顯著升高，而ATP 水平顯著下降；凍藏8 個月可導致肌肉中甜菜堿、葡萄糖、麥芽糖和肌苷水平顯著升高，而甘氨酸和ATP 水平顯著下降。凍藏對肝胰腺物質的影響較小，凍藏2 個月并未引起肝胰腺物質的顯著變化，但之后的凍藏時間均導致酪氨酸、肌苷和尿嘧啶水平顯著升高，而丙氨酸水平顯著下降。除此之外，凍藏4 個月導致肝胰腺中谷氨酰胺和苯丙氨酸水平顯著升高，凍藏6 個月還導致肝胰腺中谷氨酰胺和甘氨酸水平顯著升高，凍藏8個月導致肝胰腺中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和色氨酸水平顯著升高(圖5)。上述與凍藏顯著相關的肌肉和肝胰腺代謝物的相關系數見表2。

圖4 長期凍藏過程中軟殼蟹肌肉提取物的OPLS-DA 得分圖(A-D)和相關系數圖(A’-D’)Fig.4 OPLS-DA scores plots (A-D) and corresponding color-coded correlation coefficient loadings plots (A’-D’) generated by comparisons between the spectra obtained from extracts of muscle of soft-shell crabs during long term frozen storage

圖5 長期凍藏過程中軟殼蟹肝胰腺提取物的OPLS-DA 得分圖(A-C)和相關系數圖(A’-C’)Fig.5 OPLS-DA scores plots (A-C) and corresponding color-coded correlation coefficient loadings plots (A’-C’) generated by comparisons between the spectra obtained from extracts of hepatopancreas of soft-shell crabs during long term frozen storage

為了解軟殼蟹組織小分子營養物質隨凍藏時間的變化，本研究采用單變量統計方法分析了部分代謝物水平相對于對照的變化。結果表明，在長期凍藏條件下，軟殼蟹肌肉中變化最大的物質是肌苷，肌苷水平隨著凍藏時間的延長而持續增加，至凍藏8 個月時肌苷水平已經比對照(M1)增加了4.6 倍(圖6)。其次是麥芽糖和葡萄糖，這兩種糖的水平也隨著凍藏時間延長持續升高，至凍藏8 個月時分別比對照(M1)增加了4.4 和2.5 倍。而其他肌肉代謝物的變化均小于1倍。與軟殼蟹肌肉組織類似，肝胰腺的肌苷水平變化最大，隨著凍藏時間延長持續升高，至凍藏8 個月時比對照(H1)增加了3.6 倍。其次是谷氨酰胺和尿苷水平在不同凍藏期內產生了波動，最高水平分別出現在凍藏2 個月(1.7 倍)和凍藏4 個月(1.6 倍)時。其他肝胰腺代謝物的變化均較小。

3 討論

本研究采用基于NMR 的代謝組學技術共檢出軟殼蟹可食組織中的34 種代謝物，這些物質大部分已在三疣梭子蟹[23]和擬穴青蟹[27]中被發現，個別物質如尿苷不常被NMR 檢測到，可能與尿苷濃度較低有關。這些檢出的代謝物是軟殼蟹組織中的高豐度物質，對軟殼蟹質量和風味具有重要作用。

盡管-20℃凍藏和LN 凍結均對短期凍藏的軟殼蟹代謝譜無顯著影響，但-20℃凍藏仍導致軟殼蟹肌肉中DMA 和肝胰腺中肌苷水平的倍增，而LN 凍結可抑制這兩種物質的增加。盡管DMA 不如魚類腐敗指標三甲胺(trimethylamine，TMA)[28]一樣被廣泛使用，但DMA 連同TMA 和氨氣是腐敗魚類特征性腥味的主要組成，也是魚類肉質新鮮度指標——總揮發性鹽基氮的重要組成[29]。此外，DMA 也可作為魚類風味和肉類質地的間接評價指標[30]。這是因為在TMAO 分解形成DMA 的過程中，可形成等摩爾量甲醛。甲醛可導致蛋白質交聯，從而使魚肉變硬。因此，凍藏軟殼蟹肌肉中DMA 水平的升高不僅可以說明蟹肉新鮮度的下降，而且可以用來指示蟹肉質地的下降。但LN凍結抑制了凍藏軟殼蟹肌肉中DMA 水平的升高，表明LN 凍結能較好地維持短期凍藏軟殼蟹肌肉的新鮮度和質地。此外，已有研究表明，凍藏條件下的DMA通過非酶途徑產生，即DMA 是由細菌分解產生[31]，本研究中凍藏軟殼蟹肌肉中DMA 含量的升高是否與細菌活動有關值得進一步研究。

表2 軟殼蟹肌肉和肝胰腺提取物中顯著變化的代謝物的相關系數Table 2 The correlation coefficients of significantly altered metabolites in the muscle and hepatopancreas extracts of soft shell crabs

肌苷是ATP 水解產物之一[32]。在魚類死亡后，ATP 被依次降解為腺苷二磷酸、AMP 和肌苷單磷酸(inosine monophosphate，IMP)。ATP 降解為IMP 是一個快速自溶的過程，但IMP 繼續被降解為肌苷和次黃嘌呤相對緩慢，而且伴隨著自溶和微生物活動[33]。因此，肌苷含量的升高與自溶變質和細菌腐敗都有關系，可作為魚冷藏過程中新鮮度的指標[34]，也作為魚類新鮮度評價的另一個重要指標——K 值的重要貢獻因子[35]。此外，肌苷具有苦味[36]，因此，凍藏軟殼蟹肝胰腺中肌苷水平的升高可能指示著肝胰腺新鮮度的下降和苦味的增加。但LN 凍結可抑制凍藏軟殼蟹肝胰腺肌苷水平的升高，表明LN 凍結能較好地維持短期凍藏軟殼蟹肝胰腺的新鮮度和口感。盡管本研究只采用短期凍藏來評價LN 凍結對軟殼蟹質量的影響，可能更長時間的凍藏更能顯示LN 凍結的效果，但7 d 凍藏時間已經顯示LN 凍結對軟殼蟹在凍藏過程中新鮮度和口感下降的減緩效應。

圖6 長期凍藏過程中軟殼蟹營養物質的變化Fig.6 Relative changes for muscle and hepatopancreas nutrients in the soft shell crabs during long term frozen storage

LN 凍結雖然在軟殼蟹短期凍藏中發揮了較好的保鮮效果，但在長期凍藏中，軟殼蟹的小分子營養物質仍然發生了顯著變化。這些變化主要發生在肌肉的肌苷、麥芽糖和葡萄糖以及肝胰腺的肌苷、谷氨酰胺和尿苷的升高。特別是肌苷在8 個月的凍藏過程中增加了3～5 倍，但這個增速相對于未用LN 凍結的軟殼蟹來說相對減緩，因為凍藏7 d 的軟殼蟹肝胰腺中肌苷升高了1 倍，盡管相應肌肉組織中的肌苷變化較小。由于肌苷水平的增加指示著軟殼蟹新鮮度的下降和苦味的增加，因此長期凍藏會對軟殼蟹的新鮮度和風味產生影響。但值得關注的是，經LN 凍結的軟殼蟹中DMA 水平在8 個月凍藏期間均未顯著升高，表明LN凍結仍然起到了減緩軟殼蟹腐敗的作用。而其他物質如肌肉中麥芽糖和葡萄糖以及肝胰腺中谷氨酰胺的升高，顯然有助于軟殼蟹肌肉具有更高的甜味和肝胰腺具有更好的鮮味[36]。此外，其他營養物質如肌肉中的ATP、延胡索酸和甜菜堿等以及肝胰腺中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和尿嘧啶等在軟殼蟹凍藏過程中發生了明顯波動，這些物質屬于核苷類、有機羧酸、有機酸和有機堿類，必然導致軟殼蟹風味的變化，同時也影響軟殼蟹的質量。但這些物質在凍藏前后的水平變化較小，因此，可能對軟殼蟹風味和質量的影響相對有限?？傊?，LN 凍結處理的軟殼蟹雖然在凍藏8 個月期間發生了小分子營養物質的明顯波動，但除肌苷的升高可能對軟殼蟹的新鮮度有不利影響外，其他物質的變化影響可能較小，甚至具有積極影響。

4 結論

本研究在軟殼蟹肌肉和肝胰腺中共檢出34 種代謝產物，其中大部分是氨基酸。-20℃凍藏和LN 凍結均對短期凍藏的軟殼蟹代謝譜無顯著影響，但-20℃凍藏仍導致肌肉的二甲胺和肝胰腺的肌苷水平倍增，而LN 凍結能抑制這兩種物質的增加。而長期凍藏可導致LN 凍結軟殼蟹肌肉的肌苷、麥芽糖和葡萄糖以及肝胰腺的肌苷、谷氨酰胺和尿苷水平顯著升高。表明LN 凍結可有效緩解長期凍藏軟殼蟹的質量下降。本研究為LN 凍結在軟殼蟹凍藏中的應用提供了方法參考。