殼聚糖基碳量子點的制備、表征及其對過氧化氫的熒光檢測研究

滿華盛 呂霞敏 黃建穎

(浙江工商大學食品與生物工程學院/浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310018)

碳量子點(carbon dots，CDs)，也稱碳點或碳納米點，是一類新興的準球形熒光碳納米材料。CDs 于2004年由Xu 等[1]在鈍化單壁碳納米管過程中首次發現，由于其具有優良的水溶性，光致發光性，良好的生物相容性和低毒性以及表面功能的可調性而逐漸引起關注[2]。CDs 具有普遍的共性，如紫外熒光特性就是被廣泛研究和報道的重要特性之一[3-4]。CDs 在制備過程中因其原料的不同，表面會形成不同的親水性官能團，如羥基、氨基和羧基等，被認為是造成其獨特光學性質的重要原因[5]。此外，CDs 的表面易于修飾，摻雜氮、硫或金屬離子都可能會進一步改進其光學特性，甚至增加新的功能[6]。在過去十幾年里，CDs 已被廣泛應用于傳感器[7]方面，而良好的生物相容性和低毒性[8-9]將它與傳統的基于過渡金屬的量子點和有機染料[10-11]區分開來，非常適用于生物或食品體系。

殼聚糖是自然界中資源豐富且廉價易得的陽離子多糖，有著豐富的氮含量及表面基團，但其難溶于水，在很大程度上限制了自身的應用范圍，因此將其應用于高性能氮摻雜CDs 的制備，無疑是制備環境友好型CDs 的極佳選擇。另外作為一種氮含量豐富的天然可再生資源，殼聚糖基新型氮摻雜CDs 的制備有助于拓寬CDs 和殼聚糖在各領域的應用范圍。

過氧化氫(H2O2)是一種強氧化劑，主要應用于化工、醫藥和環境等領域[12]，同時H2O2在許多國家被用作漂白劑、食品包裝抗菌劑和貯存用殺菌劑，如應用于小麥粉、食用油和雞蛋等。但是，為保障H2O2處理后食品的安全性，H2O2溶液濃度應小于3%[13]。對于食品加工來說，控制H2O2的殘留極其重要。目前，已報道多種H2O2的檢測方法，如高效液相色譜[14]、分光光度[15-16]、熒光[17-19]、化學發光[20]以及電化學[21-22]法。然而這些方法通常存在分析時間長，維護費用高，非現場檢測等缺點，另外在綠色CDs 未被開發關注前，為使絕大多數的CDs 獲得更好的性能，會使用有毒有害的反應原料或摻雜具有毒性的金屬離子，不利于環境保護，且限制了其在很多方面的應用。H2O2作為生活中常用的氧化消毒劑，具有一定的毒性，尤其在食品當中，若殘留超標必然會對人體健康產生不良影響。因此，開發新型準確快速檢測H2O2的方法至關重要。本研究采用殼聚糖與DL-酒石酸為反應前體，采用水熱法制備新型CDs，并對其進行表征測定，通過熒光響應的手段實現對H2O2的快速檢測，以期為高效快速檢測食品中的H2O2提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖[Chitosan，CH，脫乙酰度91%，粘度60 mPa·s (1%，20℃)]，青島弘海生物技術有限公司；DL-酒石酸(分析純)、溴化鉀(光譜純)，上海麥克林生物化學有限公司；濃硫酸、30%雙氧水、硫酸亞鐵、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS，pH 值4.0)均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RCT 型加熱磁力攪拌器，德國IKA 公司；TDW 溫度控制儀，余姚市長江溫度儀表廠；2-16KL 高速冷凍離心機，德國西格瑪公司；-80℃超低溫冰箱，上海汗諾儀器有限公司；Labconco FreeZone 立式冷凍干燥機，美國LABCONCO 公司；EL 204-IC 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-2600 紫外-可見分光光度計，RF-5301 PC 熒光分光光度計，日本SHIMADZU 公司；JEM-1010 透射電子顯微鏡，日本JEOL 公司；Nicolet Nexus 870 傅里葉變換紅外光譜儀，德國Thermo 公司；PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；Smart 系列純水/超純水儀，美國默克密理博。

1.3 試驗方法

1.3.1 殼聚糖基碳量子點的制備 參照文獻[23]的方法并略作改動。準確稱取3.9 g 殼聚糖分別溶解于50 mL 0.35 mol·L-1DL-酒石酸溶液中，60℃攪拌至膠狀，將混合物放入裝有四氟乙烯內襯的不銹鋼高壓反應釜中，200℃水熱處理5 h。自然冷卻至室溫后，將得到的混合物于10 000 r·min-1離心30 min，上清液用0.22 μm 濾膜過濾，再參照Wen 等[24]的方法并適當修改，在2 L 超純水中用透析袋(截留率為100～500 Da)透析純化48 h，所得樣品水溶液進行冷凍干燥，得到淺黃色粉末，于干燥器中保存備用。

1.3.2 碳量子點的表征

1)紫外吸收光譜的測定。使用紫外-可見分光光度計測定CDs 溶液的紫外吸收光譜，掃描范圍為200～800 nm，每個樣品測定3 次。

2)熒光發射光譜的測定。使用熒光分光光度計測定CDs 溶液的熒光發射光譜，激發波長為290 ～360 nm，掃描范圍為220～900 nm，狹縫寬度為10.0 nm，每個樣品測定3 次。

3) 透射電子顯微鏡( transmission electron microscope，TEM)測定。使用TEM 觀察CDs 的表面形態。

4)傅立葉變化紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)測定。采用KBr 壓片法制樣，使用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1的波數范圍內進行測定，分辨率為4 cm-1。

5)熒光量子產率(fluorescence quantum yield，QY)測定。以硫酸奎寧(量子產率為0.54)作為標準物質分散于0.1 mol·L-1H2SO4溶液中[24]，用來測定所制備CDs 的熒光量子產率。分別記錄CDs 溶液和硫酸奎寧的相應吸光度以及在相同激發波長(320 nm)下的發射峰面積。根據公式計算量子產率:

式中，Q 表示QY；Ⅰ表示熒光積分面積；n 表示溶劑的折射率，nCDs為水的折射率(1.33)，ns為0.1 mol·L-1H2SO4的折射率(1.33)；A 表示相應的吸光度。下標“s”指硫酸奎寧，下標“CDs”指CDs 溶液。

1.3.3 不同濃度鐵離子對0.5 mg·mL-1CDs 熒光強度影響以及H2O2標準曲線的繪制 將不同濃度0.5 mL Fe3＋溶液添加到4.5 mL CDs 溶液中，使得5 mL 混合溶液中CDs 濃度為0.5 mg·mL-1，Fe3＋濃度分別為0、10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、130、150、170、200、300…900、1 000 μmol·L-1，測量320 nm 波長處的熒光發射圖。再將0.5 mL Fe2＋溶液添加到4.0 mL 的CDs 溶液中，然后將提前配制好的不同濃度的H2O2溶液各0.5 mL 分別添加至4.5 mL 上述混合溶液中，至溶液的最終體積為5.0 mL，添加得到的H2O2濃度分別為0、10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、130、150、170、200、300…900、1 000 μmol·L-1，其中Fe2＋濃度為1 mmol·L-1，CDs 濃度為0.5 mg·mL-1，充分反應一段時間后，在室溫下記錄320 nm 激發波長下每個混合溶液的熒光發射圖譜，根據不同濃度混合溶液的熒光強度繪制CDs 溶液的熒光恢復圖譜。以H2O2濃度為橫坐標，混合溶液的相對熒光強度作為縱坐標繪制標準曲線。

1.4 數據統計與分析

每組試驗進行3 次平行，采用Excel 2010 軟件進行數據統計分析，Origin 8.0 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 紫外吸收光譜分析

CDs 溶液(0.1 mg·mL-1)的紫外吸收光譜如圖1所示。樣品水溶液在紫外-可見光譜中的寬吸收峰出現在285 nm 處，該處的吸收峰屬于氮摻雜CDs 的特征吸收峰，這是由于存在sp2域(π→π*和n→π*躍遷)[25]。插圖為CDs 溶液(1.0 mg·mL-1)在日光和紫外燈波長(365 nm)照射下的光學圖片，可以清楚看到，透明的淡黃色CDs 溶液在365 nm 波長的紫外光照射下顯示出較強的藍色熒光，表明其具有良好的光致發光性。

圖1 CDs 溶液的紫外吸收光譜Fig.1 UV-vis spectra of CDs in aqueous solutions

2.2 熒光發射圖譜分析

由圖2 可知，當激發波長介于290 ～320 nm 時，CDs 溶液(0.1 mg·mL-1)的熒光發射強度明顯增強，在激發波長為320 nm 時達到最大。由于CDs 具有較為均勻的尺寸，發射波長并未出現明顯的藍移或紅移[26]。當激發波長從320 nm 增加到360 nm 時，發射波長隨著熒光發射強度的減弱出現紅移，說明制備的CDs 具有隨激發波長而改變發射峰位置的特性[27]。樣品溶液在不同激發波長下的發射光譜證明了其多色發射的特性，這種激發依賴行為可能是因為CDs 在水熱碳化過程中表面上形成的羧基和氨基等官能團充當了激發能阱從而導致不同的光致發光特性[28]。

2.3 TEM 分析

圖2 CDs 溶液在不同激發波長下的熒光發射光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of CDs solution under the excitations with different wavelengths

TEM 是觀察納米級熒光CDs 形態的重要工具之一。由圖3 可知，透析處理所得CDs 的平均粒徑約為20 nm，且具有較寬的尺寸分布，大多數CDs 呈現近似圓形或橢圓形，并有少許聚集，這與前人報道一致[28]。

圖3 CDs 的透射電子顯微鏡微觀圖Fig.3 TEM images of CDs

2.4 傅立葉變化紅外光譜分析

為了研究氮摻雜CDs 中存在的官能團，使用FTIR 來表征其結構。由圖4 可知，對殼聚糖粉末而言，3 430 cm-1處為胺基的O-H 和N-H 的伸縮振動峰，2 878 cm-1處為C-H 特征峰[23]，1 654 cm-1和1 599 cm-1處為殼聚糖(酰胺Ⅰ)譜帶的乙酰化氨基[29]。殼聚糖水熱處理形成CDs 后，原本3 430 cm-1處胺基的特征吸收峰變為3 380 和3 205 cm-1處的兩個峰，而屬于C-H 的2 878 cm-1處的吸收峰幾乎消失。殼聚糖乙酰化氨基的C ＝O 伸縮振動峰從1 654 cm-1移至1 719 cm-1處，Sahu 等[30]研究認為是形成羥基和羧基所致，歸因于羧酸基團的C ＝O 伸縮振動，即CDs 的表面存在羧酸基團[31]。在1 600 和1 400 cm-1處的吸收峰為C＝C、C-OH 的伸縮振動和C-N 的彎曲振動，與前人報道相一致[32]，而1 000 ～1 200 cm-1處的其他尖峰則為C-O 和C-N 伸縮振動以及-OH 彎曲振動。雖然水熱碳化的機理有待進一步研究，但從紅外光譜圖的分析可以進一步證實CDs 中含有羥基、羰基和羧基等官能團，這些功能性親水基團的存在可以大大改善所制備的熒光CDs 的水溶性及穩定性[33]。另外，CDs 的紅外光譜中顯示出多個與殼聚糖不同的振動峰，表明殼聚糖經過水熱碳化形成了石墨結構。

圖4 殼聚糖和CDs 的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of chitosan and CDs

圖5 Fe3＋濃度對0.5 mg˙mL-1CDs 溶液熒光強度的影響Fig.5 Effect of Fe3＋concentration on fluorescence intensity of 0.5 mg˙mL-1 CDs solution

圖6 H2O2 濃度對CDs-Fe2＋混合溶液熒光強度(A)和相對熒光強度(B)的影響Fig.6 Effect of H2O2 concentration on fluorescence intensity (A) and relative fluorescence intensity of CDs-Fe2＋solution (B)

2.5 熒光量子產率分析

以硫酸奎寧(0.1 mol·L-1H2SO4為溶劑；QY ＝0.54)為標準物質，測定CDs 溶液和硫酸奎寧溶液相應的吸光度以及在320 nm 激發波長下兩者的發射峰面積，根據公式(1)計算得出所制備CDs 的QY 為5.22%。

2.6 不同濃度Fe3＋對0.5 mg˙mL-1 CDs 熒光強度的影響以及H2O2 標準曲線的繪制

由圖5 可知，Fe3＋對于CDs 溶液的熒光有著猝滅作用，當Fe3＋濃度到達1 000 μmol·L-1時熒光幾乎完全消失。另外，由圖6 可知，Fe2＋與CDs 溶液混合后熒光依舊較強，當添加不同濃度的H2O2時，CDs-Fe2＋混合溶液的熒光發射光譜如圖6-A 所示，隨著H2O2濃度的增加，CDs-Fe2＋混合溶液的熒光強度逐漸降低，當添加的H2O2濃度達到1 000 μmol·L-1時，熒光幾乎完全猝滅。研究進一步揭示了CDs-Fe2＋混合溶液的熒光強度與H2O2濃度在0 ～60 μmol·L-1范圍內具有良好的線性關系(圖6-B)，可作為標準曲線，回歸方程為F/F0＝-3.614 4×C(H2O2)＋0.995 3，相關系數(R2)約為0.990 0，其中F0和F分別是不存在和存在H2O2時CDs-Fe2＋混合溶液在320 nm 激發波長處的熒光強度，根據公式3S/k(其中S 表示標準偏差，k 是線性回歸方程的斜率)，預估檢測限為0.65 μmol·L-1。

3 討論

本研究以殼聚糖和酒石酸為反應前體，水熱處理制備了熒光量子產率為5.22%的新型氮摻雜CDs，經透射電鏡測得其粒徑約為20 nm，TEM 圖中顆粒穩定性較好，并采用傅里葉變換紅外光譜等對其進行結構表征，證明形成了石墨烯結構且其表面存在豐富的含氧和氮的功能性官能團，熒光效應較好并能用于檢測。

本研究結果表明，Fe3＋可以淬滅殼聚糖衍生的氮摻雜CDs 的熒光，而同等濃度Fe2＋對其影響不大，由此推斷，H2O2將Fe2＋氧化為Fe3＋，Fe3＋與CDs 產生配位，同時它可以轉移到Fe3＋的空d 軌道，從而導致混合溶液的熒光猝滅，這是一個靜態猝滅過程，與前人的報道一致[34]。因此CDs-Fe2＋氧化還原型熒光開關傳感器可以成為檢測H2O2的理想傳感器。這種新型熒光傳感器，對比已報道的其他方法，如Pradeep 等[35]利用 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺( 3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB)與其自制的綠色CDs 混合來檢驗H2O2，其檢測限為35 μmol·L-1，而本研究采用更易獲得且環保的Fe2＋與CDs 混合，無需昂貴的設備，也不用復雜的操作步驟或苛刻的試驗條件，響應范圍類似，且檢測限更低，靈敏度更高。但本研究制備的熒光傳感器偏向于定量監測食品中H2O2或氧化自由基的含量，對于成分定性的研究有待進一步深入。

4 結論

本研究以氮含量豐富的殼聚糖及酒石酸作為反應前體，通過溫和的水熱處理制備得一種新型氮摻雜CDs，并利用Fe2＋和H2O2之間的氧化反應構建了可用于分析H2O2的熒光傳感器，可定量檢測低濃度下的H2O2，具有易于操作，安全環保，線性范圍寬，檢測限低，靈敏度高和響應速度快等優點，在食品和生物系統中具有巨大的應用潛力。