馬拉硫磷對照品的制備

溫芳，張秀英，郭桂芳，陸連壽，萬仁玲，郝利華，鞏忠福

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

馬拉硫磷是一種較早應用的有機磷殺蟲劑,主要以觸殺、胃毒合熏蒸毒殺滅害蟲，具有廣譜、低毒、使用安全等特點。我國、美國及歐盟等均批準其作為獸藥使用，美國[1]和歐盟[2]已將馬拉硫磷及其制劑收錄入藥典中，并可提供馬拉硫磷及其雜質(zhì)的對照品，我國已將精制馬拉硫磷原料及制劑收錄入2017年版《獸藥國家標準》[3](化學藥品卷)中，但還未提供相關標準物質(zhì)。

為控制馬拉硫磷產(chǎn)品質(zhì)量，滿足獸藥產(chǎn)品檢驗需求，本研究參照美國藥典、歐洲藥典以及我國2017年版《獸藥國家標準》(化學藥品卷)擬定了馬拉硫磷對照品質(zhì)量標準，依據(jù)該質(zhì)量標準對馬拉硫磷對照品候選物進行了全面質(zhì)量控制，并以美國藥典委員會提供馬拉硫磷對照品作為溯源對照品，通過協(xié)作標定方法對馬拉硫磷對照品候選物進行定值，經(jīng)專家組審查，現(xiàn)已入庫發(fā)放，填補了我國獸藥標準物質(zhì)研制的一項空白。

1 材料與方法

1.1 材料 馬拉硫磷對照品(批號：1374408，含量99.2%)和異馬拉硫磷對照品(批號：1349604，含量97%)，美國藥典委員會提供；馬拉硫磷對照品候選物(純度99.2%)，山東省化學農(nóng)藥及中間體產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站提供；甲醇、丙酮，色譜純；水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水；高效液相色譜儀e2695，美國waters公司提供；氣相色譜儀7890A，Agellent公司提供；XP105天平，METTLER公司提供；787KFTitrino水分測定儀，瑞士萬通公司提供。

1.2 方法

1.2.1 相對密度 按《中國獸藥典》(2015版)一部[4]相對密度測定方法中的比重瓶法測定。

1.2.2 鑒別

1.2.2.1 取本品 2 mL，加甲醇2 mL，搖勻，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，搖勻，靜置2 min，再加0.5 mol/L硫酸溶液數(shù)滴，使溶液呈無色，加醋酸銅試液2 mL，生成深黃色沉淀；

1.2.2.2 高效液相方法 在含量測定項下記錄的色譜圖中，馬拉硫磷對照品候選物溶液主峰的保留時間應與馬拉硫磷對照品溶液主峰的保留時間一致。

1.2.3 檢查

1.2.3.1 游離酸 取本品約2 g，精密稱定，加無水乙醇20 mL和溴酚藍指示液數(shù)滴，搖勻，用氫氧化鈉滴定液(0.02 mol/L)滴定至溶液為藍色，同時以空白試驗校正。

1.2.3.2 異馬拉硫磷[1-2]色譜條件：照含量測定項下的色譜條件進行試驗，檢測波長為210 nm，異馬拉硫磷和馬拉硫磷的相對保留時間分別為0.5和1.0。

測定法：精密稱取異馬拉硫磷對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含0.1 mg的異馬拉硫磷對照品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密稱取馬拉硫磷對照品候選物適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含20 mg的馬拉硫磷溶液，同法測定。平行測定2份異馬拉硫磷對照品和2份馬拉硫磷對照品候選物，按外標法以峰面積計算馬拉硫磷對照品候選物中異馬拉硫磷含量。

1.2.3.3 水分測定方法 按照《中國獸藥典》(2015版)一部[4]水分測定法第一法費休氏法進行。

1.2.4 含量測定方法 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗：用高效液相方法測定[1-3]。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(30 cm×3.9 mm,10 μm)；以甲醇-水(50∶30)為流動相；檢測波長為254 nm；流速1.0 mL/min。理論板數(shù)按馬拉硫磷峰計算不低于2500，與相鄰峰的分離度應符合要求。

測定法：精密稱取馬拉硫磷對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含10 mg馬拉硫磷對照品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；精密稱取馬拉硫磷對照品候選物適量，同法配制并測定。按外標法以峰面積計算馬拉硫磷對照品候選物中馬拉硫磷含量。平行測定2份馬拉硫磷對照品和5份馬拉硫磷對照品候選物。

1.2.5 定值方法 協(xié)作標定方法： 3家單位協(xié)作標定；含量測定按照1.2.4 高效液相方法進行；每家單位均由2人進行測試；每人測試平行樣不少于5份(每人測試用對照品至少應取2份)；單人平行樣的相對標準偏差應小于0.5%，2人間的相對偏差應小于0.3%。3家單位協(xié)作標定，測定結果進行加權平均計算。

2 結果與分析

2.1 相對密度 測定結果為1.23。

2.2 鑒別

2.2.1 生成深黃色沉淀；

2.2.2 馬拉硫磷對照品 候選物溶液主峰保留時間為16.999，馬拉硫磷對照品溶液主峰保留時間為16.994，保留時間一致。圖譜見圖3和圖4。

2.3 檢查

2.3.1 游離酸 用空白試驗校正后，測得游離酸的結果為0.02%；

2.3.2 異馬拉硫磷 將濃度約為0.1 mg/mL的2份異馬拉硫磷對照品溶液和濃度約為20 mg/mL的2份馬拉硫磷對照品候選物溶液，分別進樣2針。異馬拉硫磷和馬拉硫磷的相對保留時間分別為0.5和1.0。按外標法計算馬拉硫磷對照品候選物中異馬拉硫磷的含量，其平均值為0.06%，修約為0.1%，具體實驗結果見表1。異馬拉硫磷對照品圖譜見圖1，馬拉硫磷對照品候選物圖譜見圖2。

表1 馬拉硫磷對照品候選物中異馬拉硫磷含量測定結果

圖1 異馬拉硫磷對照品圖譜

圖2 馬拉硫磷對照品候選物圖譜

2.3.3 水分測定結果 用3份重蒸水標定費休氏試液，得F值為3. 564 5；測定3份供試品的水分平均值為0.1%。

2.3 含量測定結果

2.3.1 系統(tǒng)適應性結果 將濃度約為10 mg/mL的馬拉硫磷對照品溶液連續(xù)進樣5針，其峰面積的相對標準偏差為0.2%，理論塔板數(shù)大于2500，與相鄰峰的分離度符合方法要求。

2.3.2 含量測定結果 將濃度約為10 mg/mL的2份馬拉硫磷對照品溶液和5份馬拉硫磷對照品候選物溶液，分別進樣2針，按外標法計算5份馬拉硫磷對照品候選物的含量，其含量平均值為98.77%，修約為98.8%，實驗結果表明該候選物滿足制備馬拉硫磷對照品原料的要求。具體實驗結果見表2。馬拉硫磷對照品圖譜見圖3，馬拉硫磷對照品候選物圖譜見圖4。

圖3 馬拉硫磷對照品圖譜

圖4 馬拉硫磷對照品候選物圖譜

表2 馬拉硫磷對照品候選物含量測定結果

3 定值結果

3.1 協(xié)作標定結果 協(xié)作標定結果、加權平均計算結果和合并計算結果分別見表3、表4和表5：

表3 協(xié)作標定結果匯總表

表4 3家單位協(xié)作標定結果的加權平均值

表5 3家單位標定結果加權平均值的合并計算

3.2 定值結果 對3家單位協(xié)作標定結果進行加權平均計算，得出馬拉硫磷對照品候選物含量的加權平均值為98.99%，相對標準偏差為0.3%，修約為99.0%，所以本研究制備的馬拉硫磷對照品含量賦值為99.0%。

4 討論與結論

WHO發(fā)布的化學對照品一般指導原則規(guī)定用于含量測定用對照品需要至少3家實驗室對其進行協(xié)作標定；中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制定的《獸藥標準物質(zhì)研制技術規(guī)范(試行)》也規(guī)定新獸藥標準物質(zhì)采用溯源標準物質(zhì)定值時，原則上應由2個以上(含2個)外部實驗室協(xié)作標定，所以本次制備的馬拉硫磷對照品采用外標法，由3家單位協(xié)作標定來定值，保證了馬拉硫磷對照品含量賦值的準確性和重現(xiàn)性。

我國2017年版《獸藥國家標準》(化學藥品卷)收錄的馬拉硫磷原料含量測定方法為氣相法，但在研究過程中發(fā)現(xiàn)，通過改變柱溫、氣體流速、分流比等色譜條件[5]，馬拉硫磷主峰中仍有1小峰未能完全分離，所以用氣相方法測定馬拉硫磷含量存在定量準確性的問題，所以本研究參照美國藥典和歐盟藥典用高效液相方法作為制備馬拉硫磷對照品的含量測定方法。

當對照品用于專屬性的含量測定方法時，確定雜質(zhì)的含量是很重要的。本研究參照美國藥典及歐盟藥典質(zhì)量標準增加了對雜質(zhì)異馬拉硫磷的質(zhì)量控制，保證了馬拉硫磷對照品含量定值結果的準確性。

3家單位協(xié)作標定結果相對標準偏差為0.3%，滿足用高效液相方法對標準物質(zhì)定值的統(tǒng)計學要求。