三葉青片劑的質量標準研究

周煜恒，徐惠龍，蘇瀾，余佳敏，許文*，范世明*，徐偉

(1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建 福州 350122)

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，別名金錢吊葫蘆，全草均可入藥[1-2]，其地下塊根又名蛇附子[3]。近年來，關于三葉青的現代藥理作用研究較多，其在抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]、降脂[7]、保肝[8]等方面都顯示出了良好的作用，并且現代化學研究表明三葉青中的黃酮類成分是主要的活性成分[9]，且具有良好的安全性[9]，黃酮類成分被作為三葉青質量評價的重要指標性成分[10-14]。

近年來關于三葉青開發利用上，三葉青制劑多為湯劑或散劑[15-17]，但湯劑存在需臨用前煎煮制備、藥液味苦、量大、散劑未經提取純化口服量大等缺點。中藥片劑具有劑量準確、質量穩定、生產成本低、服用和貯運方便等優點，課題組前期針對三葉青開展了其片劑工藝的研究，制備得到的三葉青片劑[18-19]，但對三葉青片劑的質量控制尚未建立，也未見文獻關于三葉青片劑的質量評價研究。

為了更好地控制三葉青片劑質量，本研究根據《中國藥典》2015年版(四部)制劑通則中片劑項下規定對其進行片重差異、崩解時限及硬度檢查，利用薄層色譜鑒別其主要黃酮成分，采用紫外分光光度法測定其總黃酮的含量，并采用高效液相色譜測定三葉青片劑中8個主要成分的含量，建立三葉青片劑的質量標準，為三葉青片劑的開發利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1290高效液相色譜儀(安捷倫公司)；Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech有限公司)；CPA225D 型十萬分之一分析天平(德國 Sartorius 公司)；KQ-500E 臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-1800 紫外分光光度計(日本島津公司)；TDP-1.5單沖壓片機TDP-1.5(上海超億制藥機械設備有限公司)；LB-2D型崩解時限測定儀(上海黃海藥檢儀器廠)；YD-200B片劑硬度測定儀(上海銘翔藥檢儀器有限公司)；硅膠G預制薄層板(青島海洋化工廠分廠，批號：20180612)。

1.2 試藥 牡荊素(批號：MUST-160308)、異牡荊素(批號：MUST-150711)、葒草苷(批號：MUST-130705)、異葒草苷(批號：MUST-131009)、牡荊素鼠李糖苷(批號：MUST-130506)、綠原酸(批號：MUST-327979)、新綠原酸(批號：MUST-906332)和隱綠原酸(批號：MUST-905997)均購自成都曼思特生物科技有限公司，HPLC純度均≥98%。樹脂HP20(日本三菱公司)，聚維酮K30(PVP-K30)、乳糖、微晶纖維素(MCC)、硬脂酸鎂、羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)、交聯聚維酮(PVPP)均為藥用級(安徽山河藥用輔料股份有限公司)。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純(Merck公司)；三乙胺為色譜純(阿拉丁試劑上海有限公司)，水為Milli-Q Direct 16超純水機制備(Millipore公司)。三葉青由寧化縣益珍農業科技有限公司提供，經福建中醫藥大學藥學院藥用植物實驗室范世明正高級實驗師鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)的全草，藥材存放于福建中醫藥大學藥學院標本室。

2 方法與結果

2.1 三葉青片劑制備 依據課題組前期對三葉青提取、純化和制劑工藝考察[18-19]，簡述如下：三葉青藥材3 000 g，經粉碎機粉碎，過40目篩，得三葉青粉，備用。將三葉青粉置于多功能提取罐中，加入20倍量70%乙醇，回流提取90 min，提取2次，合并濾液濃縮到生藥計1 g·mL-1的濃縮液。取HP20樹脂，以徑高比1∶5裝柱，取三葉青濃縮液按照0.5 g生藥/g樹脂上樣量上樣后，靜置1 h，以流速6 BV·h-1(BV為樹脂床體積)的超純水進行除雜，用量為4 BV。采用50%乙醇4 BV，以流速2 BV·h-1進行富集洗脫，收集富集液濃縮，冷凍干燥24 h，平行制備3批三葉青劑凍干粉。按照三葉青片劑制備，按照處方比例，三葉青凍干粉∶填充劑=1∶2，填充劑為微晶纖維素∶乳糖=1∶1.5，內加5%主藥量的崩解劑PVPP∶CMS-Na=1∶1，加入5%主藥量的用85%乙醇配制的3%PVP K30黏合劑，以85%乙醇為潤濕劑，“握之成團，輕捏即散”軟材于20目篩制粒，置于60 ℃烘箱干燥、整粒，加入潤滑劑硬脂酸鎂為顆粒量的0.6%，壓制成片，即得3批三葉青片劑各1 000片(每片折算生藥約3 g)。

2.2 性狀 3批次三葉青片劑均為棕色片，味微苦，表面光滑，色澤均勻，見圖1。

圖1 三葉青片劑外觀性狀

2.3 片劑項下的檢查[20]

2.3.1 片重差異 根據《中國藥典》2015年版(四部)制劑通則中片劑項下重量差異的檢查方法進行檢查，3批次的三葉青片劑平均片重分別為0.455 1、0.453 0、0.454 7 g，重量差異均在±5%內，符合規定。

2.3.2 崩解時限 按照《中國藥典》2015年版(四部)崩解時限檢查法進行檢查，3批三葉青片劑崩解時限均在15 min內，符合《中國藥典》規定。

2.3.3 硬度檢查 片劑應具有適宜硬度，3批三葉青片劑的平均硬度為26～27 N，硬度符合規定。

2.4 薄層鑒別

2.4.1 供試品溶液 取3三葉青片劑適量，研細，稱取約0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，加25 mL甲醇超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，濾過得供試品溶液。

2.4.2 對照品溶液 取牡荊素、異牡荊素、葒草苷、異葒草苷及牡荊素鼠李糖苷對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成濃度分別為0.465、0.429、0.414、0.499、0.445 mg·mL-1的單一對照品溶液，分別取各單一對照品溶液1 mL置于5 mL量瓶中，搖勻即得混合對照品溶液。

1.葒草苷；2.異葒草苷；3.牡荊素；4.牡荊素鼠李糖苷；5.異牡荊素；6、10.SYQP_ZS001(5、2 μL);7、11.SYQP_ZS002(5、2 μL)；8、12.SYQP_ZS003(5、2 μL)；9.混合對照品溶液；13.陰性空白圖2 三葉青片劑5個黃酮類成分薄層色譜圖

2.4.3 鑒別方法與結果 分別吸取葒草苷、異葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素對照品溶液各2.0 μL，混合對照品溶液5 μL，供試品溶液各2.0 μL和5.0 μL點于同一硅膠G薄層板上(青島海洋)，以乙酸乙酯∶甲酸∶甲苯∶水=8∶1∶1∶1為展開劑系統展開(溫度26 ℃，濕度65%)，取出晾干，噴以3%AlCl3顯色劑，于105 ℃下加熱5 min，365 nm紫外燈下檢視。結果表明三葉青片劑供試品薄層色譜中與葒草苷、異葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素對照品同一位置上呈現相同顏色的清晰斑點，陰性空白(單純輔料片劑)無干擾，結果見圖2。

2.5 三葉青片劑總黃酮含量測定

2.5.1 供試品溶液制備 取三葉青片劑適量，研細，稱取約0.05 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，加25 mL甲醇超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，濾過得供試品溶液。另取等量空白片劑制備空白陰性溶液。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取牡荊素對照品22.2 mg，加入適量甲醇制得濃度1.10 mg·mL-1的對照品儲備液，進一步用甲醇稀釋制成濃度46.25 μg mL-1的對照品溶液。

2.5.3 顯色方法及檢測波長的選擇 參考課題組之前建立的三葉青總黃酮測定方法[13]，精密吸取牡荊素對照品5 mL于25 mL的容量瓶中，加甲醇至6 mL，加1%三乙胺定容至刻度，搖勻，顯色30 min。精密吸取供試品溶液1 mL于25 mL的容量瓶中，加甲醇至6 mL，加1%三乙胺定容至刻度，搖勻，顯色30 min。對照品和供試品溶液均以顯色劑作為空白對照。在300～500 nm范圍內進行掃描。結果顯示，對照品與供試品溶液在400 nm處有相同吸收峰，故選擇400 nm作為檢測波長，見圖3。

圖3 牡荊素(1)和供試品(2)的紫外光譜圖譜

2.5.4 線性關系考察 精密吸取“2.5.2”項下的牡荊素對照品各1、2、3、4、5、6 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇至6 mL，按“2.5.3”項下方法顯色測定吸光度，以對照品溶液的濃度與吸光度值建立標準曲線，得線性回歸方程：A=0.048 4C-0.022 4，r=0.999 3。結果表明，在1.85～11.10 μg mL-1范圍內線性關系良好。

2.5.5 精密度試驗 精密移取對照品溶液5 mL，供試品溶液1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇至6 mL，按“2.5.3”項下方法顯色測定吸光度，在同一紫外分光光度計上連續測定6次，結果對照品溶液和供試品溶液RSD分別為0.03%、0.10%，表明試驗精密度良好。

2.5.6 穩定性試驗 精密移取對照品溶液5 mL，供試品溶液1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇至6 mL，按“2.5.3”項下方法顯色后分別在0、8、15、30、60、90、120、240 min測定吸光度。結果表明，對照品和供試品顯色產物在室溫下30～240 min內穩定，RSD分別為0.67%、2.54%。

2.5.7 重復性試驗 精密稱取批號為SYQP_ZS001的三葉青片劑6份，按“2.5.1”項下方法制成供試品溶液，精密吸取1 mL，置于25 mL容量瓶中，按“2.5.3”項下方法顯色后測定吸光度，計算含量，結果該批次的三葉青片劑中總黃酮含量平均為117.48 mg·g-1，RSD為2.57%，說明重復性良好。

2.5.8 加樣回收試驗 取重復性試驗同批三葉青片劑(SYQP_ZS001)0.025 g，精密稱定，加入近似樣品總黃酮含量的對照品量(1∶1)，按“2.5.1”項下方法制成供試品溶液。精密吸取1 mL置于25 mL量瓶中，按“2.5.3”項下方法顯色后測定吸光度，平行6份。結果該方法平均加樣回收率為98.43%，RSD為2.46%，見表1。

表1 加樣回收率試驗

2.5.9 樣品含量測定 精密吸取“2.5.1”項下的3批次供試品溶液各1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，按“2.5.3”項下顯色后測定吸光度，計算得制備的3個批次的三葉青片劑中總黃酮含量分別為117.48、124.02、112.56 mg·g-1。

2.6 HPLC-DAD 測定三葉青片劑8個成分的含量

2.6.1 色譜條件 采用Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，流速0.4 mL min-1，柱溫30 ℃，進樣量：5 μL，梯度洗脫：98%A(0～5 min)，98%A→90%A(5～15 min)，90%A→88%A(15～30 min)，88%A→80%A(30～50 min)，80%A→98%A (50～65 min)；檢測波長330 nm，對照品和供試品溶液中8個成分理論塔板數均大于5 000，色譜分離良好，陰性無干擾(見圖4)。

1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.異葒草苷；5.葒草苷；6.牡荊素鼠李糖苷；7.牡荊素；8.異牡荊素圖4 混合對照品(A)和供試品(B)色譜圖

2.6.2 供試品溶液的制備 取“2.5.1”項下制備的3批次供試品溶液。

2.6.3 對照品溶液的制備 取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素對照品適量，精密稱定，加入甲醇制備濃度分別為1.273、1.15、1.092、0.66、0.593 6、0.318、0.596 8、0.599 6 mg mL-1的對照品儲備液，進一步用甲醇稀釋制備濃度為127.30、115.00、109.20、66.00、59.36、31.80、59.68、59.96 μg mL-1的混合對照品溶液。

2.6.4 線性和范圍 精密吸取“2.6.3”項下制備的混合對照品溶液，用50%甲醇分別稀釋制備得到梯度濃度的混合對照品溶液，精密吸取5 μL進樣，并測定峰面積，以濃度X(μg·mL-1)對峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程和相關系數，并稀釋不同濃度對照品得各個化合物的定量限(S/N為10)和檢測限(S/N為3)，結果見表2。

表2 8個待測物的回歸方程、線性范圍及定量限和檢出限

2.6.5 精密度試驗 精密吸取同一份對照品混合溶液5 μL，一天內連續進樣6次，連續進樣3 d，記錄8個成分的峰面積，其峰面積日內精密度和日間精密度的RSD范圍均在1.39%～2.01%，表明精密度良好。

2.6.6 穩定性試驗 制備一份供試品，取該供試品溶液分別于0、2、4、6、10、12和24 h進樣分析，記錄8個成分的峰面積，其峰面積的RSD范圍均在0.86%～1.46%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6.7 重復性試驗 精密稱取同一批三葉青樣品6份，制備成供試品溶液進樣測定峰面積，計算8個成分的含量，其含量RSD范圍均在1.39%～2.94%，表明方法重復性良好。

2.6.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品(SYQP_ZS001)0.025 g，平行6份，精密加入近似1∶1的8個對照品，制備成供試品溶液進樣測定峰面積，計算含量，見表3，得到平均回收率為96.88%～99.25%，RSD為1.94～2.47%。

表3 8個待測物的加樣回收率試驗結果

2.6.9 樣品含量測定 取“2.5.1”項下供試品溶液，進樣5 μL，測定峰面積，根據標準曲線計算其含量，結果見表4。

表4 三葉青片劑中8個待測物的含量(mg·g-1)

3 討論

3.1 薄層鑒別條件的優化 在考察不同點樣量的試驗過程中，發現點樣量為5.0 μL時，斑點較大，拖尾嚴重，供試品不易分離；點樣量為2.0 μL時，分離效果較好，斑點清晰。在考察不同展開劑的試驗過程中，發現分離5種黃酮成分，使用展開劑為乙酸乙酯∶甲酸∶甲苯∶水=10∶1∶1∶1或乙酸乙酯∶甲酸∶甲苯∶水=8∶1.2∶1∶1時，斑點不易分離，拖尾，以乙酸乙酯∶甲酸∶甲苯∶水=8∶1∶1∶1為展開劑時，斑點清晰，分離較好。在考察使用不同顯色劑顯色時發現，使用10%硫酸-乙醇顯色黃酮成分時，斑點不靈敏，用3%AlCl3溶液顯色斑點清晰，因此選擇3%AlCl3溶液作為顯色劑。另外，三葉青中還有含量較高的綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸的，其鑒別采用乙酸乙酯∶甲酸∶甲苯∶水=17∶2∶2∶0.8為展開劑系統，發現可以較好地區分綠原酸，但是新綠原酸和隱綠原酸分離不好，暫時不列入標準。

3.2 總黃酮含量測定 紫外分光光度法測總黃酮含量時，常用方法有NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3-KAc法和三乙胺法顯色法[13]，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法和AlCl3-KAc法，發現牡荊素成分在光譜上均未見明顯紅移，而采用三乙胺顯色法測定時，牡荊素和供試品在波長400 nm下均有最大吸收波長，特異性較好，顯色條件經優化采用1%三乙胺，顯色時間為30 min即可穩定。

3.3 色譜條件的優化 用高效液相色譜測定三葉青片劑中8個主要成分，在選擇色譜柱時，通過比較不同廠家不同粒徑色譜柱分離效果，最終選擇Welch UHPLC Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm)。在選擇流動相系統時，通過比較不同的流動相系統：乙腈-0.1%甲酸水，甲醇-0.1%甲酸水，乙腈-水，甲醇-水。試驗結果表明，使用乙腈-0.1%甲酸水為流動相，8個成分的分離度最好。且在光譜掃描中，在330 nm下，8個成分均有最大吸收波長，因此選擇330 nm下檢測，經過含量測定發現3個批次三葉青片劑中，含量最高的成分為綠原酸，含量達到46.68～52.06 mg·g-1，其次是牡荊素和異葒草苷，含量均大于20 mg·g-1，其次是牡荊素和異葒草苷，8個成分的總和達到124.66～139.17 mg·g-1。

本文研究了三葉青片劑的質量標準，通過性狀、片重差異、崩解時限及硬度檢查對三葉青片劑進行檢查，符合《中國藥典》2015年版(四部)制劑通則中片劑項下規定；采用薄層色譜法鑒別三葉青片劑中5種黃酮成分(異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素)，用紫外分光光度法測定三葉青片劑總黃酮含量，采用高效液相色譜法測定三葉青片劑中8個主要成分含量，為三葉青片劑的質量控制與研究開發提供試驗依據。

致謝：感謝澳門大學中華醫藥研究院陸金健博士課題組對三葉青制劑及質控合作研究中的協助。