參透基因定位方法和流程

北京

基因定位就是確定基因在細胞中的位置，本文將按照三個步驟進行基因定位：第一步，將基因定位在細胞質(zhì)或細胞核（X 染色體、Y 染色體、常染色體）；第二步，將基因定位在具體染色體；第三步，將基因定位在染色體的具體位置。筆者利用已知的形態(tài)學標記、細胞學標記、DNA 分子標記等技術(shù)，采用經(jīng)典遺傳學、細胞遺傳學、分子遺傳學的相關(guān)方法，結(jié)合具體題目，對基因定位進行深度解析。

1.定位在細胞質(zhì)或細胞核（X 染色體、Y 染色體、常染色體）

一般可采用家系調(diào)查、發(fā)病率調(diào)查（關(guān)注♀、♂差異）、正反交實驗等經(jīng)典遺傳學方法進行基因定位，需注意人類不可設(shè)計正反交實驗，但可尋找正反交案例，如表1。

表1

2.定位在具體染色體

一般可利用已知的形態(tài)學標記、細胞學標記、DNA分子標記等技術(shù)進行基因定位，觀察待測基因與已知標記是否存在連鎖關(guān)系，從而將其定位于具體染色體。

2.1 形態(tài)學標記

形態(tài)學標記即已知基因?qū)?yīng)的性狀，一般肉眼可見。待測基因與已知基因遺傳時若遵循基因自由組合定律，則待測基因與已知基因位于非同源染色體上；若遵循連鎖互換定律，則待測基因與已知基因位于一對同源染色體上。此方法的特點：數(shù)量少、周期長、多態(tài)性少、受環(huán)境影響等。

【例1】P1 為新發(fā)現(xiàn)的黃瓜果實苦味純合品系，將其與P3（隱性純合）雜交得F1，F(xiàn)1測交結(jié)果如表2，已知控制果皮光澤、果皮綠色深淺、刺瘤密稀性狀的基因，分別位于黃瓜的4、6、7 號染色體上，推測控制P1 果實苦味的基因位于____號染色體上。

表2

【參考答案】7

【解析】①②測交結(jié)果遵循基因自由組合定律，所以苦味基因不位于4、6 號染色體上；③測交結(jié)果符合連鎖互換定律，所以苦味基因位于7 號染色體上。

2.2 細胞學標記

細胞學標記一般要用顯微鏡觀察。借助已知的染色體變異，包括染色體數(shù)目變異的單體、三體、細胞融合技術(shù)；染色體結(jié)構(gòu)變異的缺失、易位等。若待測基因與其存在連鎖關(guān)系，即可確定基因位于該號染色體上。此方法的特點：幾乎不受環(huán)境影響、數(shù)量少、材料獲取困難、費時、費力、有些標記對生物有害等。

2.2.1 利用染色體數(shù)目變異——單體

已知某隱性突變基因（a）位于常染色體上，現(xiàn)有某號染色體單體的顯性個體，利用其探究a 基因是否在該號染色體上。過程如圖1 所示：

圖1

若F1顯性性狀∶隱性性狀=1 ∶1，可推知該基因位于單體所在的該號染色體上；若F1全部是顯性性狀，可推知該基因不在該號染色體上。

2.2.2 利用染色體數(shù)目變異——三體

已知某隱性突變基因（a）位于常染色體上，現(xiàn)有某號染色體三體的顯性個體，利用其探究a 基因是否在該號染色體上。過程如圖2 所示：

圖2

若F2顯性性狀∶隱性性狀=5 ∶1，可推知該基因位于三體所在的該號染色體上；

若F2顯性性狀∶隱性性狀=1 ∶1，可推知該基因不在該號染色體上。

2.2.3 利用染色體數(shù)目變異——細胞融合技術(shù)

已知人鼠細胞融合過程中，鼠細胞會完整保留，人細胞染色體會隨機丟失，利用含有不同數(shù)量和類型人染色體的雜種細胞，表達出不同的人類基因產(chǎn)物，如表3 所示（+代表有，-代表無）。

表3

推知：a 基因位于1 號染色體，b 基因位于2 號染色體，c 基因位于1 號染色體，d 基因位于2 號染色體。

2.2.4 利用染色體結(jié)構(gòu)變異——缺失

誘變處理顯性純合子的花粉使其發(fā)生染色體片段缺失，然后為隱性純合子母本授粉。

圖3

對F1表現(xiàn)為隱性性狀的個體進行細胞學鑒定，觀察其發(fā)生缺失染色體為幾號染色體，即可推測控制該性狀的基因位于該號染色體缺失區(qū)段。

2.2.5 利用染色體結(jié)構(gòu)變異——易位

A 品系相互易位涉及基因連鎖群Ⅱ和Ⅸ，B 品系相互易位涉及基因連鎖群Ⅱ和Ⅻ，前者涉及染色體 7 和染色體9，后者涉及染色體9 和染色體11。

可知:基因連鎖群Ⅱ?qū)儆谌旧w9，基因連鎖群Ⅸ屬于染色體7，基因連鎖群Ⅻ屬于染色體11。

2.3 DNA 分子標記

DNA 分子標記即已知的可遺傳并可檢測的DNA 序列。可用PCR 技術(shù)、DNA 分子雜交技術(shù)或DNA 測序技術(shù)等來檢測。此方法的特點：直接以DNA 形式呈現(xiàn)，不受環(huán)境影響；數(shù)量多；多態(tài)性高；多呈共顯性；可鑒定基因型；遵循遺傳規(guī)律；需要技術(shù)支持。此方法主要用于基因定位、遺傳圖譜制作、親緣關(guān)系鑒定、基因型分析等方面。

2.3.1 基于PCR 技術(shù)的DNA 分子標記

短串聯(lián)重復序列（SSR），如圖4 所示，其內(nèi)側(cè)為1-6bp核苷酸串聯(lián)重復序列；兩側(cè)序列高度保守（設(shè)計引物），特點為可PCR 擴增；種類多、分布廣；有多態(tài)性、共顯性。

圖4

【例2】圖4 發(fā)現(xiàn)某人類罕見遺傳病，對其進行深入研究，請回答下列問題：

（1）通過對患者進行_____調(diào)查得到圖5 所示圖譜，據(jù)圖5 可初步斷定該病為_____性遺傳病，致病基因位于_____染色體上。

圖5

（2）為確定該病在幾號染色體上，提取家系成員的血細胞DNA，利用多組“微衛(wèi)星DNA”分子標記進行鑒定，其中利用________技術(shù)擴增5 號染色體上的M 分子標記結(jié)果如圖5（與系譜圖成員上下對應(yīng)），根據(jù)圖6 中信息選擇一組合適的引物：______ 。

圖6

（3）根據(jù)圖5 分析，除Ⅲ8 外所有患者均有_____（填“M1”“M2”“M3”或“M4”）類型的分子標記，說明致病基因與其高度連鎖，所以該致病基因位于______號染色體上。

（4）據(jù)圖5 分析Ⅱ3、Ⅱ4 基因型（用A、a 表示）和相應(yīng)分子標記并標在圖7 相應(yīng)位置。

圖7

（5）據(jù)圖5 推斷Ⅲ8基因型為______，若電泳圖顯示其有M3M4 分子標記，分析其產(chǎn)生的可能原因________。

【參考答案】（1）家系 顯 常 （2）PCR b、c （3）M2 5 （4）Aa aa

圖8

（5）Aa Ⅱ3減數(shù)分裂形成配子時同源染色體非姐妹染色單體發(fā)生交叉互換產(chǎn)生AM3 雌配子，與Ⅱ4的aM4雄配子結(jié)合，形成受精卵發(fā)育成Ⅲ8個體

【解析】（1）因為該病為罕見遺傳病所以針對患者進行家系調(diào)查；由于Ⅱ1、Ⅱ4不攜帶致病基因且連代遺傳，所以該病為顯性遺傳病；Ⅱ2為男性患者而Ⅲ1為女性正常人，所以不可能為伴X 染色體顯性遺傳，推知致病基因位于常染色體。（2）DNA 擴增需用PCR 技術(shù)進行,引物結(jié)合在兩側(cè)保守序列的3'端。（3）據(jù)圖5 分析，所有患者都有M2 標記，可知致病基因與其高度連鎖位于5 號染色體。（4）電泳點樣孔在上方，所以越接近點樣孔分子標記越大，即重復次數(shù)越多，反之越小，所以分子標記如圖7，Ⅱ3、Ⅱ4的基因型分別是Aa、aa，M2 與A 連鎖，所以確定基因相應(yīng)位置（如圖8）。（5）Ⅲ8基因型為Aa，分子標記卻是M3M4，說明Ⅱ3的A 沒有與M2 一起進入配子，所以原因是Ⅱ3減數(shù)分裂形成配子時同源染色體非姐妹染色單體發(fā)生交叉互換產(chǎn)生AM3 雌配子，與Ⅱ4的aM4 雄配子結(jié)合，形成受精卵發(fā)育成Ⅲ8個體。

2.3.2 基于DNA 分子雜交技術(shù)的DNA 分子標記

限制酶切片段長度多態(tài)（RFLP），如圖9 所示，RE限制酶可將DNA 切出不同長度的片段，DNA 堿基改變導致其酶切位點改變，限制酶切片段結(jié)合特定探針可作為分子標記。待測基因與該分子標記緊密連鎖，進行基因定位。

圖9

【例3】成人型多囊腎病具有明顯的家族性，一般在35 歲以后逐漸發(fā)病，α-珠蛋白-3'HVR 探針是該病早期診斷的常用方法。研究人員利用α-珠蛋白-3'HVR 探針及電泳等相關(guān)技術(shù)對某患者家族的1～7 號成員進行DNA檢測，結(jié)果如圖11 所示。請回答問題：

圖10 成人型多囊腎病遺傳系譜

圖11 α-珠蛋白-3'HVR 探針檢測的電泳結(jié)果

（1）研究發(fā)現(xiàn)該家族的成人型多囊腎病由顯性基因控制，據(jù)圖10 分析，該病的致病基因位于______（填“常”“X”或“Y”）染色體。

（2）人的16 號染色體上α-珠蛋白基因的3′端容易發(fā)生突變，α-珠蛋白-3′HVR 探針能夠根據(jù)___________原則檢測該區(qū)突變片段的差異，綜合圖10、圖11 結(jié)果分析，患者都具有的α-珠蛋白基因片段是_________kbp。

（3）被檢測的α-珠蛋白基因與成人型多囊腎病基因高度連鎖，可以推斷該致病基因位于___號染色體上，且在染色體的位置上距離__________基因比較接近。

【參考答案】（1）常 （2）堿基互補配對 7.0（3）16 α-珠蛋白

【解析】（1）已知該病為顯性，由1 號為正常人而4 號為患者可推知該病的致病基因不位于X 染色體，而是位于常染色體。（2）探針檢測根據(jù)堿基互補配對原則，電泳圖中所有患者均有7.0 kbp。（3）α-珠蛋白基因與成人型多囊腎病基因高度連鎖，所以致病基因位于16號染色體，因高度連鎖所以距離α-珠蛋白基因比較接近。

2.3.3 基于測序技術(shù)的DNA 分子標記

單核苷酸多態(tài)性（SNP）主要是用以寡核苷酸雜交為基礎(chǔ)的DNA 芯片技術(shù)，直接以序列變異作為標記（如圖12），是目前使用最廣泛的標記。

圖12

【例4】SNP 是基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA 序列多態(tài)性。科研人員利用SNP 對擬南芥抗鹽突變體的抗鹽基因進行定位。

（1）SNP 在擬南芥基因組中廣泛存在，在不同DNA分子及同一DNA 分子的不同部位存在大量SNP 位點，某些SNP 在個體間差異穩(wěn)定，可作為DNA 上特定位置的遺傳______。

（2）研究者用化學誘變劑處理野生型擬南芥，處理后的擬南芥自交得到的子代中抗鹽∶不抗鹽=1 ∶3，據(jù)此判斷抗鹽為_______性狀。

（3）為進一步得到除抗鹽突變外，其他基因均與野生型相同的抗鹽突變體（記為m），可采用下面的雜交育種方案。

步驟一：抗鹽突變體與野生型雜交；

步驟二：_____________________；

步驟三：_____________________；

步驟四：多次重復步驟一～步驟三。

（4）為確定抗鹽基因在Ⅱ號還是Ⅲ號染色體上，研究者用抗鹽突變體m 與另一野生型植株B 雜交，用分別位于兩對染色體上的SNP1 和SNP2（如圖13）進行基因定位。

圖13

①將m 和B 進行雜交，得到的F1植株自交。將F1植株所結(jié)種子播種于________的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到F2抗鹽植株。

②分別檢測F2抗鹽植株個體的SNP1 和SNP2，若全部個體的SNP1 檢測結(jié)果為________，SNP2 檢測結(jié)果SNP2m 和SNP2B 的比例約為________，則抗鹽基因在Ⅱ號染色體上，且與SNP1m 不發(fā)生交叉互換。

【參考答案】（1）標記 （2）隱性 （3）得到的F1自交 篩選抗鹽突變體 （4）①含（一定濃度）鹽 ②均為SNP1m1 ∶1

【解析】（1）據(jù)題意SNP 可作為遺傳標記。（2）據(jù)性狀分離比可判斷抗鹽為隱性性狀。（3）據(jù)題意，雜交育種的目的為得到除抗鹽基因突變外，其他基因均與野生型相同的抗鹽突變體。（4）據(jù)題抗鹽基因位于Ⅱ號染色體，突變體具有抗鹽隱性性狀，所以F2所有抗鹽個體抗鹽基因均與SNP1m標記連鎖，與Ⅲ號染色體的SNP2 存在自由組合關(guān)系，所以SNP2m和SNP2B的比例約為1 ∶1。

3.定位在染色體具體位置

3.1 計算重組率

同源染色體的非姐妹染色單體發(fā)生交叉互換，導致同源染色體上的非等位基因重組，非等位基因距離越近，它們之間發(fā)生交換概率越小，形成重組型配子概率越小，反之則越大，DNA 分子標記也遵循該規(guī)律。利用兩點或三點測驗法計算重組型配子所占比例即可推出基因之間及基因與分子標記之間的相對距離，進而繪制出遺傳圖譜，單位cM。

【例5】已知控制玉米籽粒有色（C）/無色（c）、飽滿（S）/凹陷（s）、非糯（W）/糯性（w）的三對基因均位于9 號染色體上，請根據(jù)下列三個實驗，確定無色凹陷糯性個體9 號染色體上三個基因的位置關(guān)系。

表4

圖14

【參考答案】

圖15

【解析】Cc-Ss 重組率：4%；Ww-Ss 重組率：20%；Ww-Cc 重組率：24%；所以無色（c）、凹陷（s）、糯性（w）基因的相對距離如圖15。

【例6】已知某致病基因A 位于5 號染色體上，其上還有兩種“微衛(wèi)星DNA”分子標記M、N，統(tǒng)計基因和分子標記類型為AaM1M2N1N2 個體產(chǎn)生配子種類和比例為AM2N2 ∶aM1N1 ∶AM2N1 ∶aM1N2 ∶AM1N2 ∶aM2N1=10 ∶10 ∶3 ∶3 ∶2 ∶2，若只考慮交換一次，請在圖16中標出AaM1M2N1N2個體的基因和分子標記位置。

圖16

【參考答案】

圖17

【解析】根據(jù)配子種類和比例可知AM2N2 連鎖，aM1N1 連鎖，均位于5 號染色體上。Aa-M1M2 重組率：4/30；Aa-N1N2 重組率：6/30；M1M2-N1N2 重組率：10/30，所以位置關(guān)系如圖17。

3.2 利用已知序列轉(zhuǎn)座子或T-DNA

利用已知序列的轉(zhuǎn)座子或T-DNA 的隨機插入，導致基因突變，推知基因功能，根據(jù)已知序列設(shè)計引物或探針，可測得基因位置、獲取基因序列。

【例7】根據(jù)T-DNA 的已知序列，利用PCR 技術(shù)可以擴增出被插入的基因片段。其過程是提取_________植株的DNA，用限制酶處理后，再用___________將獲得的DNA片段連接成環(huán)（如圖18），以此為模板，從圖中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取______作為引物進行擴增，得到的片段將用于獲取該基因的全序列信息。

圖18

【參考答案】突變體 DNA 連接酶 B、C

【解析】只有突變體植株的DNA 被已知T-DNA 插入，所以提取突變體的DNA，用限制酶切割后用DNA 連接酶連接成環(huán)，利用T-DNA 的已知序列設(shè)計引物擴增被插入基因的序列，A、C 為順時針方向，B、D 為逆時針方向，擴增被插入基因需B、C 這組引物。

3.3 原位雜交法

原位雜交法為根據(jù)目的基因序列設(shè)計探針，直接與變性的染色體DNA 按堿基互補配對原則雜交，通過檢測記錄雜交信號進行基因定位，流程如圖19。

圖19

總之，基因定位的方法很多，本文主要是利用已知的標記技術(shù)結(jié)合經(jīng)典遺傳學、細胞遺傳學、分子遺傳學的方法進行基因定位，最終繪制出遺傳圖譜和物理圖譜。