芬戈莫德預處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織炎癥反應的影響

李 娜，張 磊，王建楠，李 靜，喬嘉璐，王奕丹，隋汝波

腦缺血性卒中，是指各種原因所致腦部血液供應障礙，導致局部腦組織缺血、缺氧性壞死，而出現(xiàn)相應神經功能缺損的一類臨床綜合征[1]。其已成為我國居民死亡的首要原因[2]。目前治療手段中，不論是急性期的靜脈溶栓、機械取栓，還是后續(xù)的抗栓、他汀類藥物降脂穩(wěn)定斑塊治療，仍有26%～43%的患者病情進展加重[3]，目前考慮可能與水腫、持續(xù)低灌注及缺血再灌注損傷等相關。靜脈溶栓及機械取栓雖然在治療上可直接疏通阻塞血管，實現(xiàn)血管再通，但此種治療方法的關鍵問題——治療時間窗很大程度上限制了治療的進行，同時，腦缺血再灌注損傷亦不容忽視[4]，而目前臨床應用清除氧自由基、神經保護劑等治療效果欠佳，積極控制血壓可能有效，但目前具體控制范圍尚不明確[5]。所以深入探討有效治療手段勢在必行。

芬戈莫德(FTY720)為一種新型口服免疫抑制劑，在神經系統(tǒng)疾病治療中的作用機制有FTY720對神經細胞的直接保護作用、促進微血管形成、減少淋巴細胞從淋巴結的流出及促進淋巴細胞歸巢、阻止病灶處小膠質細胞激活、通過mTOR/p70S6K通路降低神經元自噬、減少帕金森病相關蛋白及多巴胺能神經元丟失等諸多方面。目前FTY720已被批準用于治療多發(fā)硬化[6]。有研究報道FTY720對大鼠腦出血繼發(fā)神經損傷具有保護作用[7]；在大鼠自閉癥模型中，F(xiàn)TY720可改善大鼠空間障礙、學習障礙[8]，說明其具有神經保護作用；近年研究指出FTY720亦可減輕急性缺血性卒中損傷模型動物的癥狀。其機制可能與外周淋巴細胞遷徙及中樞膠質細胞活化進而引發(fā)炎癥反應相關。基于目前研究表明的缺血性卒中存在炎癥反應機制，F(xiàn)TY720或可作為一種新藥物應用于腦血管疾病。

炎癥因子升高機制研究表明p38MAPK(mitogen-activated protein kinase，MAPK)磷酸化可能與此過程相關[9，10]。p38MAPK在下游可與NF-κB通路聚集，調控其炎癥介質的產生和作用[11，12]。p38MAPK通路在缺血損傷腦組織中顯著升高，有報道提到結扎大鼠雙側頸總動脈致缺血7 min后再灌注，發(fā)現(xiàn)大鼠海馬區(qū)小膠質細胞內p38MAPK活性增強，并且p38MAPK抑制劑可有效減少神經元死亡[13]，其機制可能與直接降低下游炎癥反應相關以及與小膠質細胞表型轉化相關(見圖1)。由此我們想探討FTY720能否改善局灶性缺血再灌注模型神經缺損癥狀及減輕神經元損傷，而這一保護作用是否與p38MAPK通路和炎癥因子相關。

圖1 腦缺血性卒中后免疫反應

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 8 w齡(250～300 g)SD大鼠雌雄各半。錦州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學SPF實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 硫酸氫氯吡格雷片(賽諾菲)；芬戈莫德(Sigma公司)；TTC染料(南京生物建成有限公司)、組織蛋白提取試劑盒(Bestbio)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Bestbio)；IL-1βELISA試劑盒(云克隆生物技術有限公司)、IL-6 ELISA試劑盒(云克隆生物技術有限公司)。p-p38MAPK抗體(Afinity Biosciences)、NF-κB抗體(Afinity Biosciences)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 實驗分為假手術組、空白對照組、氯吡格雷組及FTY720組；氯吡格雷組給予硫酸氫氯吡格雷7.71 mg/(kg·d)1次灌胃，F(xiàn)TY720組給予硫酸氫氯吡格雷7.71 mg/kg+FTY720 0.6 mg/(kg·d)1次灌胃，空白對照組及假手術組給予同體積生理鹽水日1次灌胃，給藥時間為造模前連續(xù)7 d及造模后24 h內給藥1次。

1.2.2 建模及取材 實驗動物采用改良的Longa法建立腦缺血卒中模型，術前12 h給予大鼠禁食水處理，術前應用25 g/L的水合氯醛進行大鼠腹腔內注射麻醉，大鼠仰臥位固定，作頸正中切口，分離出右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，在近顱底處將翼腭動脈剝離，并將其起始部結扎，在ECA殘端剪一小孔，將魚線經小孔插入ECA至ICA，插入約18 mm可感受輕微受阻，表明線頭端觸及大腦前動脈(ACA)近端壁，將大腦中動脈(MCA)起始部阻斷。造模成功標準：大鼠有前肢為重的偏癱及右側Horner征。假手術組操作至剝離翼顎動脈結束。栓塞2 h后實行再灌注。再灌注24 h后每組取大鼠經右側頸內動脈灌注0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛固定腦組織(n=12)，斷頭取腦后泡入多聚甲醛存于4 ℃留用；斷頭冰上活取海馬組織(n=6取材時間控制在1 min左右)。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 行為學指標 Longa評分 0分：未見相關行為障礙；1 分：癱瘓側前爪無力；2分：行走向癱瘓側傾斜、轉圈；3分：行走向患側歪倒；4分：無肢體活動、意識喪失。

1.2.3.2 TTC染色 取-20 ℃凍存20～30 min左右腦組織質地略硬的大鼠大腦組織，應用刀片冠狀面方向將整個腦組織平均切成5個切片，每層約2～3 mm厚，將其放入預先配置完成并于37 ℃水浴鍋中預熱的染料中染色20～30 min，觀察染色情況。

1.2.3.3 HE染色 取大腦海馬組織經脫水、透明、浸蠟與包埋，將蠟塊常規(guī)切片，HE染色觀察大鼠海馬組織形態(tài)學改變。

1.2.3.4 ELISA法測定IL-1β、IL-6水平 取適量組織塊，在預冷PBS中(0.01 mol/L，pH=7.0～7.2)中清洗去除血液，切成小塊，均勻的放入放置在冰上的裝有新鮮裂解緩沖液中(質量體積比1∶20～1∶50)，將得到的懸濁液經超聲處理至澄清，勻漿液10 000 r/min離心5 min，取上清。實驗前按說明書標準品、實際準備；加樣100 μl，37 ℃孵育1 h；甩干，加檢測液A 100 μl，37 ℃孵育1 h；洗板3次；加檢測液B 100 μl，37 ℃孵育1 h；洗板5次；加TMB底物90 μl，37 ℃孵育10～20 min；加終止液50 μl，立即450 nm讀數(shù)。

1.2.3.5 Western Blot測定p-p38MAPK、NF-κB水平 將樣品去根蛋白提取試劑盒提取蛋白，復合物以12，000 r/min(10 min，4 ℃)離心后，獲取上清。用BCA蛋白質測定試劑盒測定裂解物中的蛋白質水平后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離40 μg蛋白質，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用含0.1%Tween-20的TBS中的1%牛血清白蛋白在室溫下封閉膜2 h，TBST洗滌3次，用下列一抗溶液：抗p-p38MAPK抗體(1∶1000)抗NF-κB抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，第二抗體室溫孵育2 h。使用ChemiDoc-ItTMTS2成像儀(UVP，LLC，Upland，CA，USA)顯影，并使用ImageJ2x軟件程序(National Institute of Health，Bethesda，MD，USA)進行分析。

2 實驗結果

2.1 行為學指標結果 假手術組無神經功能缺失表現(xiàn)；FTY720治療組神經功能缺失評分與空白對照組(P<0.01)及氯吡格雷組(P<0.01)明顯降低(見圖2、圖3)。

注：與假手術組比較 △P<0.01；與空白對照組比較#P<0.01

2.2 TTC染色結果 假手術組大鼠腦組織未見梗死病灶，F(xiàn)TY720組大鼠梗死灶較空白對照組明顯減小(P<0.01)，較氯吡格雷組明顯減小(P<0.01)(見圖3、圖4)。

圖3 各組大鼠腦組織梗死情況

注：與假手術組比較 △P<0.01；與空白對照組比較#P<0.05

2.3 HE染色結果 假手術組大鼠海馬各區(qū)神經元形態(tài)相對完整且飽滿，排列致密而有序，空白對照組、氯吡格雷治療組及FTY720治療組中發(fā)現(xiàn)C3區(qū)神經元出現(xiàn)細胞萎縮，排列紊亂且稀疏，核固縮等現(xiàn)象，且可見有淋巴細胞浸潤，但FTY720組細胞改變程度及淋巴細胞浸潤明顯小于空白對照組及氯吡格雷組(見圖5)。

注：A：假手術組；B：對照組；C：氯吡格雷治療組；D：FTY720組

2.4 ELISA法測定海馬組織IL-1β及IL-6含量結果 FTY720組大鼠海馬組織IL-1β及IL-6含量較空白對照組(P<0.01)及氯吡格雷治療組均降低(P<0.01)；氯吡格雷組IL-1β、IL-6含量較空白對照組無明顯差異(P=0.452，P=0.133)(見圖6)。

注：與假手術組比較 △P<0.01；與空白對照組比較#P<0.01

2.5 Western-blot法測定海馬組織p-p38MAPK、NF-κB水平結果 FTY720組p-p38MAPK(P<0.01)及NF-κB(P<0.01)較空白對照組及氯吡格雷組明顯降低，氯吡格雷組較空白對照組p-p38MAPK及NF-κB水平明顯降低(P<0.01)(見圖7、圖8)。

注：A：假手術組；B：對照組；C：氯吡格雷組；D：FTY720組

注：與假手術組比較 △P<0.01；與空白對照組比較#P<0.01

3 討 論

腦缺血再灌注損傷機制錯綜復雜，國內外學者研究結果迥異，如缺血腦組織炎癥因子釋放、氧化應激、神經元凋亡等均影響缺血性卒中的預后，目前具體通過何種機制尚無明確定論。近年來在腦缺血卒中機制研究中，發(fā)現(xiàn)炎癥因子扮演著重要角色，腦缺血發(fā)生后，一方面，外周淋巴組織釋放淋巴細胞分泌炎癥因子，淋巴細胞及炎癥因子向中樞遷徙，破壞血腦屏障，造成神經組織損傷；另一方面，腦缺血后，釋放趨化因子，促使IL-1、IL-6及黏附分子等釋放[14]，引發(fā)炎癥反應，進一步損傷腦組織，實驗證明通過藥物減少IL-6、IL-23等炎癥因子的釋放，可減輕腦缺血性卒中動物模型的神經缺損癥狀及腦組織結構變化[15，16]。早期實驗發(fā)現(xiàn)p38MAPK/NF-κB通路是調節(jié)機體炎癥因子釋放的關鍵通路之一[9，10，17]，同時，如前所述，p38MAPK參與小膠質細胞的表型轉化，從而影響炎癥反應。大量實驗證明在腦缺血卒中過程中p38MAPK水平明顯升高[18]，且有報道指出，應用姜黃素、丁苯酞等藥物治療腦缺血卒中可改善神經缺損癥狀，且相應腦組織中p38MAPK明顯降低[19，20]，由此可知，p38MAPK通路在腦缺血性卒中發(fā)生過程中的重要地位，此過程可能與炎癥反應相關。

本實驗中，F(xiàn)TY720治療組大鼠的神經功能評分明顯較空白對照組及氯吡格雷組高，在宏觀癥狀上說明其可改善缺血性卒中動物的神經癥狀。有文獻曾指出FTY720可改善腦出血模型神經缺損癥狀[7，8]、自閉癥模型的記憶、行為等癥狀[11]，本實驗結果驗證了FTY720可改善腦缺血再灌注損傷模型神經功能，從個體水平驗證了FTY720的神經保護作用。此外，F(xiàn)TY720治療組動物模型中腦組織HE染色顯示細胞形態(tài)變化及淋巴細胞浸潤程度較輕，其從細胞水平上對FTY720的神經保護作用提供了證據(jù)。

FTY720的神經保護作用已得到驗證，為明確其神經保護作用的可能機制，本實驗測定了大鼠海馬組織IL-1β、IL-6水平FTY720治療組較空白對照組及氯吡格雷組明顯降低，提示FTY720可降低缺血腦組織IL-1β、IL-6水平。大量實驗證明炎癥反應參與腦缺血卒中過程，IL-1β、IL-6水平在腦缺血卒中模型腦組織中明顯增高[14]，而另有實驗應用大黃酚[21]、葛根素等[22]藥物治療后缺血卒中模型動物腦組織炎癥因子明顯減少，且改善模型動物腦缺血癥狀。本實驗中FTY720組實驗動物神經功能得到改善，因此，本實驗驗證了FTY720可通過減輕炎癥反應從而對局灶性缺血再灌注損傷起到保護作用。

p38MAPK信號通路在缺血性卒中腦組織中水平明顯升高，而應用p38MAPK抑制劑、姜黃素等藥物干預后[23，24]，缺血性卒中動物模型神經缺損癥狀得到改善，腦梗死面積縮小。p38MAPK/NF-κB通路是公認的引起下游炎癥因子釋放的一個關鍵通路，且近年研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK與小膠質細胞表型轉化相關[25]。本實驗中FTY720治療組p-p38MAPK及NF-κB水平較空白對照組及氯吡格雷組明顯降低，氯吡格雷組二者水平較空白對照組降低，但炎癥因子水平變化不具統(tǒng)計學意義，因p38MAPK既存在于膠質細胞亦存在于神經元，考慮氯吡格雷的抗血小板聚集作用降低了由于手術操作內皮損傷再栓塞，從而減少了神經元損傷的可能，而FTY720組變化更為明顯提示FTY720與氯吡格雷二者合用既有抗血小板作用又聯(lián)合抗炎作用，從而達到更顯著的治療作用。由此可見FTY720改善缺血再灌注大鼠神經功能及降低炎癥反應可能與p38MAPK途徑相關。

根據(jù)本實驗得到的結果，F(xiàn)TY720可減輕缺血造成的神經功能缺損及中樞炎癥反應，炎癥反應減輕的中樞機制一方面為p38MAPK通路對炎癥反應的影響，另一方面為小膠質細胞表型轉化對炎癥反應的影響，而小膠質細胞表型轉化的機制目前尚不完善，文獻研究可能與p38MAPK通路、STAT3通路等相關[26]，本實驗中p38MAPK水平變化雖與小膠質細胞表型轉化趨勢一致，但尚不能得出二者存在必然聯(lián)系的結論，有待于進一步研究探討。