微小RNA-124調控APLN表達在癲癇神經元損傷中的作用及機制研究

董 晗，王智昊，王 哲，高 飛，王越暉

癲癇(epilepsy)是神經系統的慢性疾病之一，發作具有反復性、不可預測性等特點。癲癇的反復發作可導致患者認知功能障礙與生活質量下降，且增加患者的死亡風險。癲癇的年發病率約為61.4/10萬人，預計全球受累患者約5000～8000萬[1]。采用抗癲癇藥物、手術等治療手段，仍有相當比例的患者病情得不到有效控制。此外，大部分抗癲癇藥物長期服用會出現一定的毒副作用，導致患者依從性降低[2，3]。Apelin(APLN)是一種生物活性肽，為孤兒G蛋白偶聯受體(APJ)的內源性配體，在血壓調節、攝食行為、垂體激素釋放及神經元損傷保護中均發揮重要作用[4]。APLN可通過抑制炎癥反應、抑制氧化應激、降低細胞內鈣濃度、抗凋亡等途徑對神經元發揮保護作用[5～8]。我們的前期研究發現APLN對癲癇神經元損傷具有明顯的保護作用，其機制涉及到調節凋亡相關蛋白表達、抑制代謝型谷氨酸受體1(metabotropic glutamate receptor 1，mGluR1)表達等[9]。然而，APLN在癲癇中的表達調控機制目前仍不清楚，現將我們的研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 神經元培養基及神經生長因子購至美國Sciencell公司，miR-124、U6、APLN等引物購至吉林庫美生物有限公司，TRIzol購至美國Invitrogen公司，SYBR Green Mix實時熒光定量PCR試劑盒、ReverTra Ace qPCR購至TOYOBO 公司，雙熒光素酶報告基因載體pmiR-RB REPORT購至銳博生物，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購至Promega 公司，胎牛血清、Opti MEM無血清培養基、流式凋亡檢測試劑盒分別購至GBICO公司、Tuoran公司與凱奇生物，APLN抗體、Bax抗體、caspase 3抗體、Bcl-2抗體及β-actin抗體購至Abcam公司。

1.2 癲癇神經元模型構建 大鼠海馬神經元購自上海康朗生物科技有限公司。采用筆者前期研究方案低鎂細胞外液培養建立癲癇神經元模型[9]。大鼠海馬神經元在維持液培養基中培養14 d后，棄掉原培養基，用低鎂細胞外液培養3 h后用PBS溶液洗兩次，后繼續轉入維持液培養基中培養20 h用于后續實驗。正常細胞外液組成成分：NaCl 145 mmol/L，KC1 2.5 mmol/L，CaCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，MgC121 mmol/L，甘氨酸0.002 mmol/L；用5 mmol/L NaOH 調節pH 至7.3，調整滲透壓在280～320 mmol/L。低鎂細胞外液組成成分：NaCl 145 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，CaCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，甘氨酸0.002 mmol/L，用5 mmol/L NaOH調節pH 至7.3，調整滲透壓在280 ～ 320 mmol/L。

1.3 細胞轉染 大鼠海馬神經元培養于6孔板，24 h后細胞融合率達到80%～90%時進行細胞轉染。采用FuGene HD轉染試劑進行轉染，具體操作步驟參照說明書。培養基含有10%的胎牛血清(150 μl)、不同類型載體(4 μg)與FuGene HD轉染試劑(7.5 μl)，室溫孵育15 min。轉染24 h后更換培養基，并去除死亡細胞。

1.4 流式細胞儀檢測 收集各組細胞于流式管中，每管細胞數2～5×105，用PBS洗2次，Annexin V染色30分，4 ℃避光。后用PBS洗2次。上機前加入5 μl稀釋PI液后，充分混勻，進行流式細胞儀檢測。

1.5 qRT-PCR檢測 收集各組細胞，采用Trizol提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。采用mRNA檢測試劑盒檢測mRNA表達，GAPDH設為對照。實驗重復3次。

1.6 蛋白印跡(western blotting)檢測 收集各組細胞，加入裂解液裂解細胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度，上樣、電泳，最后經轉膜、顯色等確定各組蛋白表達水平。檢測抗體包括Bax、Bcl-2、Caspase-3、APLN抗體，β-actin設置為對照。實驗重復3次。

1.7 雙熒光素酶系統檢測 將海馬神經元培養于24孔板。神經元培養24 h后采用Lipofectamine 2000進行細胞轉染，將miR-124 mimics、miR-124 mimics對照與APLN基因野生型、突變型載體共同轉染，繼續培養48 h，采用雙熒光素報告酶檢測系統檢測熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 miR-124與APLN靶標關系的研究 通過多個生物信息學網站預測(Target Scan、NCBI、miRbase等)，結果提示APLN基因表達可能受miR-124調控。因此，我們采用雙熒光素酶報告基因檢測系統驗證miR-124與APLN的靶標關系，將miR-124 mimics分別與APLN基因野生型、突變型、空載體3種報告基因載體進行共轉染，熒光素酶活性檢測結果見圖1。miR-124+APLN野生型組的熒光素酶活性低于miR-124+APLN突變型組和miR-124+空載體組，但差異無統計學意義；miR-124+空載體組與miR-124+APLN突變型組熒光素酶活性無明顯差異。

圖1 雙熒光素酶報告基因系統檢測miR-124與APLN的靶標關系

2.2 miR-124對神經元APLN表達的影響 將miR-124 mimics、miR-124 inhibitor與對照miRNA轉染神經元，通過qRT-PCR檢測miR-124、APLN mRNA的表達水平。結果發現miR-124 mimics組miR-124的表達水平明顯高于對照組，而miR-124 inhibitor組miR-124的表達水平顯著低于對照組(見圖2A)，提示成功地實現了對神經元miR-124的表達調控。與對照組相比，miR-124 mimics組APLN mRNA表達水平明顯高于對照組，而miR-124 inhibitor組APLN mRNA表達水平明顯低于對照組(圖2B)。

圖2 調控miR-124表達對miR-124與APLN基因mRNA表達的影響。A：miR-124 mRNA相對表達水平；B：APLN mRNA相對表達水平

采用western blotting對神經元APLN蛋白表達進行檢測，結果發現與對照組相比，miR-124 mimics組與miR-124 inhibitor組APLN表達量明顯升高，且miR-124 mimics組高于miR-124 inhibitor組(見圖3A、3B)。

圖3 調控miR-124表達對APLN蛋白表達的影響。A：不同組western blotting檢測代表性結果圖；B：不同組western blotting檢測結果的統計圖

2.3 miR-124對癲癇神經元凋亡的影響 海馬神經元癲癇模型轉染miR-124 mimics、miR-124 inhibitor與對照miRNA后，經流式細胞儀Annexin V/PI染色檢測神經元凋亡情況，結果見圖4。與對照組相比，miR-124 mimics組神經元凋亡率明顯升高，而miR-124 inhibitor轉染對神經元凋亡無明顯影響(見圖4A、4B)。

圖4 miR-124對癲癇神經元凋亡的影響。A：不同組流式細胞儀檢測神經元凋亡代表性結果圖；B：不同組神經元凋亡的統計結果

2.4 miR-124對癲癇神經元凋亡蛋白表達的影響 海馬神經元癲癇模型轉染miR-124 mimics、miR-124 inhibitor、對照miRNA，同時設置空白對照。經western blotting檢測凋亡相關蛋白Bax、Caspase 3與Bcl-2的表達情況，結果見圖5。與對照組相比，miR-124 mimics組神經元Bax(見圖5A、5B)、Caspase 3(見圖5A、5C)表達水平明顯升高，而Bcl-2(見圖5A、5D)的表達水平顯著降低。miR-124 inhibitor轉染后神經元caspase 3(見圖5A、5C)表達水平顯著降低，而對Bax與Bcl-2表達無影響(見圖5A、5B、5D)。

圖5 miR-124對癲癇神經元凋亡蛋白表達的影響。A：不同組western blotting代表性結果圖；B：不同組神經元Bax蛋白表達統計圖；C：不同組神經元caspase 3蛋白表達統計圖；D：不同組神經元Bcl-2蛋白表達統計圖

3 討 論

神經元損傷在癲癇等多種神經系統疾病的病理過程中均發揮十分重要的作用[10]。盡管癲癇小發作不一定會引起神經元損傷，但嚴重癲癇或癲癇的反復發作無疑會導致神經元損傷[11]。盡管神經元損傷與癲癇反復發作的因果關系目前尚存在一定的爭議，但動物實驗結果表明癲癇導致的海馬神經元損傷可引起癲癇發作頻率增加與嚴重癲癇的發作[12]。興奮性毒性是癲癇相關神經元損傷的重要機制。過度激活的興奮性神經遞質信號可導致大量鈣離子內流，繼而激活多條細胞內信號轉導通路，最終導致神經元損傷[13]。mGluR1在興奮毒性誘導的神經元損傷中發揮十分重要的作用[14]。筆者前期研究結果證實APLN可抑制癲癇導致的神經元凋亡，上調抗凋亡蛋白表達，下調凋亡蛋白表達，并首次發現APLN可下調mGluR1表達[9]。因此，APLN可能是癲癇預防或治療的潛在干預靶點。然而，深入研究APLN在癲癇神經元損傷中的表達調控機制具有重要的臨床意義。

作為神經系統內保守表達的微小RNA，miR-124在脊椎動物神經系統發育及多種中樞神經系統疾病中均發揮十分重要的作用[15]。miR-124在癲癇病理機制中的作用目前尚存爭議。一方面miR-124可能通過抑制神經元興奮性、延長癲癇發作潛伏期等抑制癲癇的發作，另一方面miR-124可通過激活小膠質細胞與炎癥反應等促進癲癇的發作[16]。通過多種生物信息學預測網站分析，我們發現miR-124可能調控APLN表達。因此，在本研究中我們首先通過雙熒光素酶報告基因系統分析miR-124對APLN表達的調控作用。結果提示miR-124+APLN基因野生型組熒光素酶活性低于對照組，盡管尚未達到統計學差別，提示miR-124可能與APLN直接結合。此后我們研究了miR-124對APLN表達的影響，結果顯示上調miR-124表達可明顯上調APLN mRNA與蛋白的表達，下調miR-124表達可下調APLN mRNA表達，但APLN蛋白表達無明顯降低。盡管微小RNA負調控靶基因的表達是其發揮生物學功能的主要途徑，但有證據提示微小RNA可正調控靶基因表達[17，18]。因此，上述研究結果提示miR-124可能正調控APLN基因的表達。

有研究表明miR-124具有神經保護作用，可抑制神經元凋亡[19，20]，但亦有研究報道在缺血性腦損傷中，下調miR-124表達可減少神經元凋亡、縮小腦梗死病灶[21]。采用流式檢測發現，上調miR-124表達可促進癲癇海馬神經元凋亡，而下調miR-124表達對神經元凋亡無明顯影響。機制研究也發現上調miR-124表達可上調促凋亡蛋白Bax、caspase 3表達、下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達。盡管miR-124可能正調控APLN表達，但miR-124上調并未顯示出神經保護作用，相反卻促進癲癇神經元凋亡。因此，miR-124可能通過其他機制促進神經元凋亡。

綜上，本研究結果提示miR-124與APLN基因可能存在靶標關系，miR-124可能正調控APLN表達。miR-124除可調控APLN表達外，還可能調控其他基因表達，最終表現為促進癲癇海馬神經元凋亡。因此，本研究揭示了癲癇神經元損傷中APLN表達調控的復雜性，其更為精準的表達調控機制仍有待更多研究探索。