鈦表面單寧酸絡合氯化鈣涂層接枝氯己定功能及穩定性探究

袁紅春，李向陽，王銀龍

（安徽醫科大學口腔醫學院 安徽醫科大學附屬口腔醫院 口腔疾病研究安徽省重點實驗室,安徽 合肥,230032）

種植牙因其穩固牢靠功能持久，已成為替代缺失牙不可或缺的治療方法。在考慮到合適的適應證、缺牙區解剖及個體因素，種植體植入似乎是一種安全的治療選擇[1]。種植體周圍炎與天然牙牙周炎癥狀類似[2-4]。植入物受者發生嚴重并發癥的風險很高，包括感染、無菌性松動、移位和斷裂，其中，種植體相關感染的發生率仍然很高。迫切需要制定有效的策略來降低植入物相關感染的風險及其潛在的危及生命的并發癥[5]。

酚類和多酚類廣泛分布于植物組織中，具有豐富而復雜的物理和化學性質光譜，具有廣泛的化學通用性，包括吸收紫外線輻射、清除自由基和金屬離子絡合作用[6]。我們可以利用植物多酚及其類似物的多功能性以及低成本性來形成無色多功能涂層的生物啟發方法。

以天然多酚為有機配體，金屬離子為無機交聯劑在一系列基底上來制備各種薄膜。在環境溫度下，多酚和金屬離子在水中混合后形成超分子網格結構從而會發生薄膜沉積[7]。近年來，基于酚類分子(即三酚和鄰苯二酚的組成基團)的普遍粘附特性，金屬酚醛網絡(mpn)已成為一種用途廣泛的表面改性劑。這種金屬酚胺網絡結構可以通過酚類的強黏附力，將結合金屬離子的涂層黏附到許多表面，賦予表面該金屬離子和多酚的雙重功能。這種結構目前已經被應用到石墨烯，納米金剛石，牙甚至細胞膜的表面改性中[9.9]。

氯己定廣泛應用于牙科的殺菌抑菌材料。具有低毒性，對細菌、真菌、藻類和病毒也有有效的抑制作用。氯己定的主要結構包括兩個對稱的4-氯苯基環和兩個結合在六亞甲基中心鏈上的雙胍單元，可與酚類的酚羥基發生反應[10]。因此，我們可以將單寧酸和鈣離子組成超分子網絡結構，同時接枝氯己定黏附在牙種植體表面。

本項研究擬在鈦表面通過單寧酸和氯化鈣的絡合，共價接枝氯己定，構建接枝氯己定的鈦表面，并評價其抗菌能力、生物相容性及穩定性的能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

純鈦（山西寶雞有色金屬有限公司），單寧酸、氯化鈣（美國Sigma Aldrich公司）;丙酮、Tris（上海阿拉丁試劑有限公司），腦心浸液肉湯(Brain Heaet Infusion Broth，BHI)（青島高科園海博生物技術有限公司），小鼠成骨樣細胞系（MC3T3‐E1）細胞（中國科學院上海細胞庫），金黃色葡萄球菌（上海保藏生物技術中心），胎牛血清（Gibco，新西蘭），醋酸氯己定（chlorhexidine acetate，CHX）、羅丹明 123（Sigma‐Aldrich，美國），X射線光電子能譜（X‐ray photoelectron spectroscopy，XPS）（Thermo，美國），接觸角測量儀（承德市成惠試驗機有限公司），酶標儀（BioTek，美國），培養箱（Thermo，美國），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 鈦片表面預處理

商業純鈦切割成直徑10 mm的圓形鈦片，經320、400、600、800、1000、2000目金剛砂紙打磨光滑，依次放入盛有丙酮、無水乙醇、去離子水的玻璃器皿中，超聲清洗三次，每次約5到6分鐘，取出樣品，在恒溫干燥箱中干燥備用。

1.3 單寧酸@鈣離子接枝氯己定涂層的制備

制備步驟如圖1所示，用溶質為1.21mg/ml的Tris溶液，配置單寧酸濃度為0.8mg/ml和氯化鈣1.6mg/ml濃度的溶液，將預處理過的鈦片樣品放入24孔鈦板中，分別加入單寧酸和氯化鈣500uL，充分混勻，溶液溫度20℃，浸泡24h；取出鈦片樣品，去離子水沖洗，超聲震蕩兩次，每次3到5分鐘，吹干。

將吹干后的樣品轉移到新的24孔板中，配置水溶液濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg/ml氯己定溶液，每孔加入1ml，溶液溫度20℃，浸泡24h；取出鈦片樣品，去離子水沖洗，超聲震蕩兩次，每次3到5分鐘，吹干。

1.4 表面成分表征

x射線光電子能譜（XPS）對樣品表面元素進行定性分析，證明涂層的成功構建；

1.5 表面潤濕性

采用接觸角測量儀分析樣品表面的潤濕性。將去離子水裝入針筒中，滴入到待測鈦片表面，測量水接觸角。

1.6 溶液Zeta 電位測量

將立即制備和反應24小時后的單寧酸和鈣離子反應液測量Zeta電位。

1.7 抗菌性能評價

選用種植體周圍炎常見細菌金黃色葡萄球菌，將108 CFU/L菌液80 μl接種于鈦片樣品表面上培養4 h，加入2ml的培養基，繼續培養 24 h。①每組3個樣品，分別稀釋1000倍后取80ul菌液均勻涂布至瓊脂板上，培養8h后觀察并計數平板表面菌落數。②每組取3個樣品，分別吸取150ul 溶液用酶標儀在波長為 660 nm下測量吸光度，通過濁度法評價材料抗菌能力;③每組3個樣品，分別取80ul菌液均勻涂布至瓊脂板上，將滅菌好的樣品正面與瓊脂培養基接觸，放置在瓊脂板上。培養8小時后觀察細菌生長情況和抑菌環。

1.8 生物相容性評價

圖1 單寧酸絡合氯化鈣后接枝氯己定的反應示意圖

圖2 水接觸角實驗結果

圖3 Zeta 電位實驗結果

取小鼠成骨樣細胞系MC3T3-E1 細胞培養、換液、傳代后調整細胞至適宜濃度接種于24已滅菌鈦片樣品的24孔板中（每孔108/L個細胞），于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，分別培養24小時和72小時。①每組各取3個樣品進行甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）評價，檢測細胞增殖情況。②每組各取3個樣品PBS清洗2次后，用羅丹明染色15分鐘后使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.9 穩定性實驗

將制備好的樣品浸泡在PBS中分別1，4，7，15，30，60天。定時換液并收集置換的PBS。檢測浸泡過后樣品抗菌性。

1.10 統計學處理

統計學方法：使用 SPSS 22.0 軟件，采用 K-S檢驗和 Levene 檢驗證實數據是否符合正態分布且方差齊，用“”的形式表達數據；用單因素方差分析比較各組生物相容性的總體差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖4 抗菌評價結果

2.1 樣品表征

單寧酸和鈣絡合后鈦表面 C、Ca原子百分含量比對照組增加，N、O、Ti含量下降。說明了單寧酸與鈣涂層的成功構建并黏附于鈦片表面。

2.2 表面潤濕性

空白組水接觸角為49.53±3.31，當單寧酸與鈣絡合后，由于多酚類含有酚羥基，使得未接枝氯己定組水接觸角25.36±1.27比空白組降低，但接枝不同濃度氯己定（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2）組水接觸角分別為62.96±1.27、61.35±0.25、61.96±4.50、59.96±2.72、58.07±1.35、64.87±1.38，由于氯己定帶正電荷，表現出較強疏水性，使得水接觸角較空白和未接枝組明顯增高

2.3 溶液Zeta 電位測量

隨著鈣離子濃度的增加Zeta電位數值呈現減小的趨勢。同時相較于反應前，24小時的Zeta電位幾乎都在減小，整個體系在鈣離子濃度低時較穩定，反應前較反應后穩定。

圖5 生物相容性評價

2.4 抗菌評價

圖6 穩定性抗菌評價結果

細菌稀釋培養24小時后對照組與未接枝氯己定組培養基渾濁，接枝氯己定組的培養基均澄清（圖4A）。抑菌環實驗結果顯示對照組與未接枝氯己定組未見抑菌環而接枝氯己定組見明顯的抑菌環（圖4B）。細菌涂板實驗顯示對照組與未接枝氯己定組可見瓊脂平板有金黃色葡萄球菌生長，接枝氯己定無菌落的出現（圖4C）。同時分別吸取培養基檢測OD值結果空白吸光度值0.415±0.025，未接枝氯己定組吸光度值0.434±0.089，接枝不同濃度氯己定（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2）組吸光度值分別為0.060±0.008、0.056±0.001、0.055±0.004、0.054±0.001、0.055±0.002、0.056±0.001（圖4D）。在空白鈦片表面和單寧酸絡合鈣的鈦表面可見細菌增值，在經過氯己定的接枝后，呈現了抗菌性，說明鈦片通過單寧酸與鈣的絡合與氯己定發生反應而結合，形成具有抗菌表面的涂層。

2.5 生物相容性評價

培養1天和3天后，通過MTT法檢測不同表面的成骨細胞增殖情況。一天MTT結果（圖5A）空白吸光度值0.304±0.009，未接枝氯己定組吸光度值0.300±0.016，接枝不同濃度氯己定（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2）組吸光度值分別為0.329±0.009、0.2900.027、0.309±0.033、0.292±0.022、0.316±0.017、0.300±0.009（P＞0.05）。三天MTT結果（圖5B）空白吸光度值0.425±0.038，未接枝氯己定組吸光度值0.397±0.017，接枝不同濃度氯己定（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2）組吸光度值分別為0.366±0.019、0.315±0.019、0.371±0.011、0.342±0.010、0.353±0.032、0.348±0.006（P＞0.05）。一天熒光顯微鏡觀察細胞增值結果結果（圖5C）與三天熒光顯微鏡觀察細胞增值結果（圖5D）顯示細胞的數目以及形態良好與對照組無明顯差異。

2.6 穩定性實驗

抑菌環實驗(圖6A)空白組無抑菌環，涂層PBS浸泡1、4、7、14、30、60天可見抑菌環。涂板計數實驗（圖6B）空白組菌落數平均值144，涂層PBS浸泡1、4、7、14、30、60天均未見菌落。細菌增值實驗（圖6C）空白吸光度值0.280±0.005，涂層PBS浸泡1、4、7、14、30、60天吸光度值0.068±0.001、0.0630.001、0.062±0.001、0.063±0.001、0.062±0.001、0.063±0.001。浸泡后的涂層仍具有良好的抗菌性，說明接枝的氯己定仍結合在鈦片表面發揮抗菌作用。

3 討論

鈦及其合金由于具有良好的生物相容性和力學性能，是牙科和生物醫學種植中最常用的材料[11]。但其無抗菌能力，所以對種植體周圍炎很難防治。一般來說，細菌感染有幾個階段。最初接觸病原體和細菌粘附是感染的最早步驟。一旦細菌牢固地粘附在表面上，它們就開始增殖[12]，導致生物膜的形成。生物膜成熟后，細菌可從生物膜邊緣擴散，侵入周圍組織[13]。假體周圍組織的細胞內侵襲和骨退化是感染晚期常見的并發癥，是治療的難點[14]?？紤]到治療的困難和種植失敗的嚴重后果，確保足夠的預防措施到位，并能從感染的早期階段采取行動是至關重要的。在各種細菌中，金黃色葡萄球菌約占50%的侵襲性術后感染[15-16]。

通過對種植體表面黏附多酚和鈣離子再接枝氯己定來達到抗菌目的。通過細菌增值，抑菌環和涂板實驗說明了接枝氯成功接枝到鈦表面。通過浸泡1，4，7，14，30，60d后穩定性實驗說明氯己定能持久釋放。CHX 由于具有廣譜抗菌性和不誘發細菌耐藥性的優點[17]，已用于抗菌洗液或被制成緩釋藥物[18,19]。

酚類和多酚類廣泛分布于植物組織中，具有很強的抗氧化作用，具有潛在促進健康作用的化合物。與多種生物功能有關，如化學防御、色素沉著、結構支撐、輻射防護等，此外，食用富含植物多酚的食品和飲料據稱對健康有益[20]。最近，我們報道了一種快速、低成本的方法用于不同基材的共形涂層，在這種方法中，自然產生的多酚、單寧酸(TA)和金屬離子在底物存在的情況下簡單地混合在一起。金屬離子對多酚的吸附和同時交聯TA導致了薄膜沉積。TA的相鄰羥基為金屬離子提供了螯合位點，而TA上大量的沒食子基團促進了高效的配位驅動交聯，從而形成三維穩定的金屬-酚網絡(MPNs)。此外，薄膜沉積在幾分鐘內就完成了，而且TA和金屬離子很容易獲得，而且價格便宜[8-9]。從而得到了一種利用植物多酚及其類似物的多功能性來形成多功能涂層的生物啟發方法7。同時MTT和細胞熒光可見單寧酸螯合氯化鈣金屬網格結構以及接枝氯己定無明顯毒性。單寧酸和氯化鈣的絡合親水性的提高以及接枝氯己定的降低間接說明接枝成功，此外，選用較低濃度鈣離子絡合單寧酸是由于低濃度的鈣離子溶液體系較高濃度穩定，

綜上所述，本項研究采用單寧酸和氯化鈣黏附再鈦表面接枝氯己定。生物學評價結果顯示氯己定修飾賦予鈦抗菌性能，同時未嚴重影響鈦的細胞相容性，同時保證了鈦的細胞相容性及持久穩定性。同時可發揮多酚以及鈣離子的相應功能，在種植體和骨修復材料的鈦表面修飾中具有應用價值。