基于網絡藥理學探討桑黃治療肝炎的作用機制

丁靜，呂海芹，王鶴飛，張晗，陳文文，黨和勤，劉燕琳

(1.山東第一醫科大學第二附屬醫院藥劑科，山東 泰安 271000；2.山東省煤炭泰山療養院藥劑科，山東 泰安 271000)

桑黃(Phellinusigniarius)為多孔菌科，火木層孔菌的子實體。桑黃是食藥兩用真菌，作為中藥使用始于唐代《藥性論》味微苦、性寒，主要用于活血、止血、化飲、止瀉。長期研究表明桑黃具有抗腫瘤、抗炎、調節免疫、抗氧化等作用[1-3]。近期，有研究表明桑黃具有治療小鼠血吸蟲病肝纖維化的作用[4]。桑黃可通過抑制核因子-κB(NF-κB)的核轉移，降低腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)的分泌量，進而減低炎癥反應[5]。然而桑黃成分復雜、相關靶點研究較少，使得深入研究面臨很大困難，對肝臟疾病作用的活性成分及靶點尚未有明確研究。

網絡藥理學運用計算機模擬、多個數據庫檢索分析，通過多學科融合研究中藥活性成分在人體的作用靶點，系統闡述藥物作用機制，構建藥物與疾病之間相互作用靶點的網絡，為研究成分復雜、分子機制模糊、作用靶點較多的中草藥提供新的研究思路。本文結合網絡藥理學，通過整合桑黃多種成分、多個靶點、多種基因，系統地分析了桑黃對肝臟炎癥疾病的分子作用機制，為今后深入研究提供了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 數據庫及軟件 中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Phaimacology Database and Analysis Platform)；Uniprot數據庫；GendCards數據庫；String數據庫；DAVID數據庫；ClueGo軟件；Cytoscape 3.7.2軟件。

1.2 篩選桑黃的化學成分 本研究通過TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)中使用CancerHSP軟件檢索桑黃的所有化學成分。含有相關的化學成分共9種。對所有化學成分進行篩選，化合物口服生物利用度OB≥20%，共有3個化合物通過篩選，進行下一步研究。

1.3 桑黃活性成分作用靶點及肝炎疾病靶點的篩選 采用CancerHSP軟件對候選化合物進行檢索，得到它們對應的靶點，通過Uniprot(https：//www.uniprot.org)將靶點選為人源(human)，刪除重復靶點后得到標準化基因名。

檢索GendCards數據庫，獲得肝炎(hepatitis)的疾病靶點。將桑黃的活性成分作用靶點與肝炎疾病靶點進行比對，找出關鍵靶點進行后續分析。

1.4 構建桑黃化學成分-肝炎-靶點網絡圖 將篩選出的桑黃-肝炎有關的作用靶點基因通過Excel建立對照關系，導入Cytoscape 3.7.2，建立化合物-靶點網絡圖。網絡圖中紅色節點表示疾病，黃色節點表示化合物，紫色節點表示靶點基因，相互關系以“邊”表示。與疾病相連接的靶點即為桑黃-肝炎關鍵作用靶點，與化合物相連的邊越多說明化合物作用靶點越多。

1.5 蛋白質相互作用網絡圖(PPI) 將桑黃-肝炎關鍵靶點導入String數據庫(“Homo sapiens”種屬)，得到蛋白質相互作用網絡圖，導出相關數據，使用Cytoscape 3.7.2軟件構建PPI網絡，通過多節點之間相互作用關系分析蛋白質之間的相互作用關系。PPI圖中以“度”表示與節點有相互作用的節點數目，“度”值越大表明該節點參與生物作用越多。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路分析 通過ClueGo軟件對桑黃-肝炎作用靶點基因進行GO(gene ontology)生物學過程富集和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析。GO分析是選擇生物學過程(BP)、細胞組成(CC)和分子功能(MF)3個功能，閾值P<0.05進行分析。使用R語言對KEGG通路富集分析結果進行整理，P<0.05，列出桑黃活性成分與肝炎相關的關鍵通路。

2 結果

2.1 桑黃的活性成分及作用靶點 通過Lab of Systems Pharmacology網站中的CancerHSP數據庫檢索得到桑黃中化學成分有9種(見表1)。以口服生物利用度OB≥20%為條件對化合物進行篩選，選擇其中的(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one、Phelligridin A及Phelligridin E(結構式見圖1)3種作為桑黃的有效成分進行分析。

表1 桑黃中的9種化學成分詳細信息

2.2 桑黃-肝炎作用靶點預測 選中的3個活性成分通過CancerHSP數據庫檢索得到各自對應的作用靶點，利用Uniprot數據庫找出靶點對應的人源標準化基因，整合去重后共得到標準靶點基因30個。

由GeneCards數據庫檢索獲得肝炎的疾病靶點共11 584種，將桑黃作用靶點基因與肝炎靶點基因取交集，共得到22個基因作為桑黃-肝炎預測作用靶點進行后續分析(見圖2)。

2.3 桑黃有效成分-肝炎-靶點網絡圖 將桑黃活性成分與肝炎對應的作用靶點基因進行整理，導入Cytoscape 3.7.2作圖，得到化合物-疾病-靶點基因網絡圖(見圖3)。3個黃色中心節點為化合物節點，與中心點相連接的是各化合物對應的靶點基因(以紫色表示)。與肝炎節點(紅色)連接的靶點基因即為桑黃-肝炎關鍵基因。由圖3可以看出桑黃各化學成分與關鍵靶點之間的相互作用關系，3種化合物拓撲結構分析見表2，其中(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one和 Phelligridin E對應的作用靶點相對較多，說明兩者在桑黃臨床療效上具有重要作用。

圖1 桑黃有效成分結構式

圖2 桑黃-肝炎靶點基因交集圖

圖3 化合物-疾病-靶點網絡圖

2.4 桑黃-肝炎蛋白質PPI網絡分析 為更好地研究桑黃-肝炎作用機制，本研究采用String數據庫，物種選擇為“Homo sapiens”，導入22個關鍵靶點得到蛋白質相互作用網絡圖，將得到的結果去除一個無關聯基因后導入Cytoscape 3.7.2作圖(見圖4)。圖中每個節點代表一種靶點蛋白，節點之間連線代表兩種蛋白之間有相互作用，節點顏色越近紅色表明相互作用蛋白越多，節點顏色由紅色-黃色-綠色逐漸過渡，相互作用節點逐漸減少。

圖4 桑黃蛋白質相互作用網絡圖

表2 化合物拓撲結構分析表

使用Network Analyzer對網絡圖進行拓撲分析(見表3)，度(Degree)表示與該節點相互作用節點的數目，度值越大表明該節點參與的生物功能越多；接近中心性(betweenness centrality)和緊密度中心性(closeness centrality)是節點在整個網絡中所載的中心程度。中央有6個節點的度>5，依次為：單胺氧化酶B(MAOB)、黃嘌呤脫氫酶(XDH)、乙醛脫氫酶2(ALDH2)、SMAD蛋白3(SMAD3)、乙醛脫氫酶3A1(ALDH3A1)、細胞色素P450 2A6亞型(CYP2A6)，提示這些靶點在桑黃治療肝炎的過程中發揮了關鍵作用。

2.5 GO生物過程與KEGG通路富集分析 GO生物過程富集分析主要包括生物過程分析(bioligical process,BP)、分子功能分析(molecular function,MF)和細胞組成分析(cellular component，CC)，以闡述基因的生物學過程。本文采用ClueGO分析軟件對桑黃-肝炎的22個關鍵基因進行富集分析(P<0.05),得到GO分析結果如表4。從表中看出，在生物過程(BP)中，靶點主要涉及正向調節乙醛脫氫酶[NAD(P)+]、作用于NAD或NADP醛基或氧橋基調節氧化還原酶活性正向調控兩個生物過程。

表3 蛋白質網絡靶點及其拓撲參數

表4 關鍵靶點的生物過程富集分析

KEGG通路富集結果以相關基因比例為橫坐標，基因名稱為縱坐標，相關基因數量以點大小表示，P值以顏色表示得到四維圖(見圖5)。桑黃治療肝炎涉及糖異生/糖酵解(glycolysis/gluconeogenesis)、組氨酸代謝(histidine metabolism)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、苯丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)、丙氨酸代謝(beta-alanine metabolism)、藥物代謝(drug metabolism)等相關信號通路，各通路涉及基因由表5可見。

圖5 桑黃治療肝炎關鍵靶點KEGG信號通路富集結果

表5 KEGG信號通路相關靶基因

3 討論

桑黃是泰山地區道地藥材，為食藥兼用真菌，明清泰山古籍曾記載具“驅邪滋補，扶正固本”之功效。桑黃味微苦，能利五臟、軟堅、排毒。桑黃化學成分研究報道較少，尤其對人體肝臟疾病作用的活性成分及靶點尚未有明確研究。為了理清桑黃的有效成分、作用靶點、分子作用機制，我們選擇了網絡藥理學進行初步探索研究。

關于桑黃藥理作用的研究較少，在常用的TCMSP數據庫中查找不到桑黃相關信息，僅能在CancerHSP軟件中檢索到9中桑黃化學成分。其中以(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one的口服吸收度(OB=32.39%)最好。經檢索，該化合物作用于多個靶點其中包括乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)，單胺氧化酶B(monoamine oxidase Type B,MAO-B)等。本研究通過對藥物化學成分和疾病靶點相互作用進行網絡拓撲分析，GO分析及KEGG分析，我們最終發現桑黃對肝炎作用的核心靶點在ALDH2、ALDH3A1、ALDH3B1、MAOB，對應的有效成分均為(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one。此成分主要通過乙醛脫氫酶(ALDH)發揮治療肝炎的作用。有大量研究表明乙醛脫氫酶(ALDH)與肝臟疾病的發生密切相關[6]。ALDH家族中共有19種功能基因，是人類肝臟中氧化乙醛的關鍵酶，對肝臟起重要的保護作用。其中以ALDH2活性最高，ALDH2主要位于肝臟中，在心臟、腎臟、肌肉、腦組織中也有表達。在Stachowicz等[7]研究中發現ALDH2的活化可以減輕非酒精脂肪性肝炎(NASH)的發展，通過激活ALDH2增加其氧化乙醛的活性可以減少非酒精性脂肪肝、酒精引起的肝細胞壞死。有研究表明ALDH2基因缺失時可以導致酒精攝入人體后出現乙醛和糖皮質激素水平增高，抑制血清中細胞因子釋放，可抑制T細胞的活化，減輕肝臟炎癥[8]。

在KEGG通路富集分析中我們得到的結論是桑黃治療肝炎的關鍵靶點包括組氨酸代謝(histidine metabolism)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、苯丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)、丙氨酸代謝(beta-alanine metabolism)、藥物代謝(drug metabolism)等相關信號通路。組氨酸可減輕高脂膳食誘導的大鼠肝損傷，對肝臟細胞有一定的保護作用[9]。有研究表明絡氨酸代謝異常可引起肝纖維化，FAH(fumarylacetoacetate hydrolase)基因剔除大鼠(簡稱Fah-/-大鼠)因為酪氨酸代謝障礙產生肝纖維化，廣泛用作肝纖維化模型[10]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法探索了桑黃主要活性成分、對肝炎作用靶點、相關生物信號通路。結果表明桑黃中(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one是治療肝炎的有效成分，其作用機制與乙醛脫氫酶(ALDH)相關，通過多個通路發生作用。為進一步深入研究桑黃作為食藥兩用真菌作用機制提供依據。