基于化學計量學的指紋圖譜法鑒別金線蓮及其混偽品

彭琴，鄒福賢，許少華，張勛，徐偉，林羽，陳抒云* ，許文*

(1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建 福州 350122)

金線蓮是蘭科開唇蘭屬植物金線蘭[Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl]的干燥全草，具有清熱涼血、祛風利濕之功效，用于治療腎炎、支氣管炎、膀胱炎、糖尿病、風濕性關節炎等[1]。金線蓮為新資源食品、珍貴的藥食同源植物，主要含有黃酮、多糖、有機酸、揮發性化合物和核苷類等[2-8]，具有抗糖尿病、抗氧化、保肝等多重功效[9-13]。

藥食同源金線蓮由于其價格昂貴，尤其是野生資源和林下仿野生種植，市場價每公斤超過萬元[3]，課題組承擔原福建省食品藥品監督管理局金線蓮質量標準提升專項，調研發現市場上充斥著存在較多的金線蓮混偽品，如長片金線蘭、滇越金線蘭、麗蕾金線蘭、臺灣銀線蘭、血葉蘭、斑葉蘭和虎耳草等[14]，這些混偽品在干燥的狀態下的外觀與金線蓮極其相似，僅憑外觀評價往往難以明辨真偽，一定程度上影響金線蓮的食用安全。林美珍等[15-16]分別對金線蓮與臺灣銀線蘭和斑葉蘭的顯微結構進行了比較區分；另有研究從多糖和總黃酮的水平比較了金線蓮與混偽品[17-19]；張鐵等[20-21]分別從DNA水平比較區分了金線蓮與滇越金線蘭和臺灣銀線蘭的區別，Hu等[22]利用ITS2序列對金線蓮及其混偽品進行了鑒定；王海閣等[23]選用了16對SSR多態性引物可用于不同品系金線蓮與臺灣銀線蘭的鑒別；Li等[24]采用近紅外技術對金線蓮、斑葉蘭和血葉蘭進行了鑒別。這些方法對區分金線蓮與其混偽品提供了技術手段，促進金線蓮與真偽的鑒定的水平，但是依然存在顯微鑒別、總黃酮、總多糖等方法專屬性不夠；近紅外法建庫樣本量大，缺乏全部混偽品的數據庫；DNA水平鑒別實驗多需要新鮮嫩葉，操作容易受到樣品干擾并且在金線蓮同屬不同種的區分上存在難度，同時以往已有研究鑒別的混偽品相對較少，多集中于斑葉蘭、血葉蘭和臺灣銀線蘭，樣品具有局限性。

現代化學研究表明不同基原金線蓮植物的化學成分有差異[25]，高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜是一種建立的化學成分基礎上的綜合的、可量化的鑒定手段，能夠用于中草藥整體質量控制的一種技術[26]。吳萍萍等[27]對齒唇蘭建立指紋圖譜并確定22個共有峰并成功用于銀線蓮的區分；隆林等[28]對興仁金線蓮進行指紋圖譜建立，確定20個共有峰；秦朋[29]對金線蓮建立指紋圖譜并確定20個共有峰；黃可可[30]對6批次廣西金線蓮建立指紋圖譜，確定7個共有峰；張藏蔓等[31]建立了不同來源金線蓮的超高效液相色譜-飛行時間質譜指紋圖譜；陳瑩[32]建立組培、栽培、野生金線蓮HPLC指紋圖譜，比較了野生金線蓮與臺灣銀線蘭、血葉蘭的相似度，這些已有的金線蓮指紋圖譜，僅僅建立了自身的指紋共有峰，對于多種混偽品的區分不夠全面，缺乏化學計量學層面的真偽鑒別，尚未提出差異標志物，并且指紋圖譜共有峰的指認較少無法有效用于金線蓮的真偽鑒別。因此本研究基于化學計量學的指紋圖譜法，對金線蓮及其混偽品進行鑒別，為金線蓮鑒別和質量控制提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 金線蓮樣品采自福建省多個金線蓮種植基地，其他混偽品于市場上收集，經福建中醫藥大學藥用植物實驗室范世明高級實驗師及生藥教研室黃澤豪教授鑒定，見表1和圖1；樣本存放于福建中醫藥大學藥學院藥用植物標本室。對照品水仙苷(純度：93.10%，批號：111997-201501)、蘆丁(純度：91.90%，批號：100080-201409)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(純度：90.80%，批號：112007-201602)、異槲皮苷(純度：92.9%，批號：111809-201403)、槲皮素(純度：97.30%，批號：100081-200406)、山柰酚(純度：95.5%，批號：110861-201611)、異鼠李素(純度：99.90%，批號：110860-201410)均購自中國食品藥品檢定研究院；紫云英苷(批號：MUST-13022)、槲皮素3,7-二葡萄糖苷(批號：MUST-19023)、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O葡萄糖苷(批號：MUST-19072)和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷(批號：MUST-19778)均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98%。

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配置光電二極管陣列檢測器)；Welch Ultimate XB-C18色譜柱[4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技(上海)股份有限公司]；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；KQ-500DE臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFY-500型500克搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；甲醇、乙醇和乙腈為色譜純(德國Merck公司)；Milli-Q超純水(美國Millipore公司)；其余試劑均為分析純。

表1 樣品信息表

A.金線蘭；B.長片金線蘭；C.滇越金線蘭；D.麗蕾金線蘭；E.大花斑葉蘭；F.血葉蘭；G.臺灣銀線蘭；H.虎耳草圖1 金線蓮及其混偽品圖

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液制備 精密稱取槲皮素3,7-二葡萄糖苷2.46 mg、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O葡萄糖苷2.79 mg、蘆丁4.94 mg、異槲皮苷6.38 mg、山柰酚-3-O-蕓香糖苷1.94 mg、水仙苷4.69 mg、紫云英苷4.48 mg、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷4.32 mg、槲皮素5.48 mg、山柰酚5.15 mg和異鼠李素2.09 mg分別到10 mL量瓶中，加入40%甲醇進行溶解并定容，精密吸取上述各對照品母液適量至20 mL量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液，濃度分別為24.6、27.9、24.7、12.76、19.4、93.8、89.6、43.2、10.96、10.3、10.9 μg·mL-1，供指紋峰定性比對使用。

1.2.2 供試品溶液制備 取金線蓮及其混偽品干燥全草粉碎，過60目篩，精密稱定0.25 g，置具塞三角瓶中，精密加入40%甲醇25 mL，稱定，在40 ℃、250 W功率下超聲處理15 min，放冷至室溫再稱量，40%甲醇補足失重，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.2.3 色譜條件 采用Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈(A)-(0.1%甲酸)水(B)，梯度洗脫0～22 min，12%A→18%A；22～34 min，18%A→24%A；34～44 min，24%A→30%A；44～52 min，30%A→40%A；52～54 min，40%A→40%A；54～58 min，40%A→12%A；58～60 min，12%A→12%A，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長360 nm，進樣量10 μL。

1.3 數據處理 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)對樣品色譜數據進行相似度評價，并計算各樣品的相對峰面積，采用SPSS 20.0統計軟件對試驗樣品色譜數據進行聚類分析和主成分分析，然后使用SIMCA-P14.1軟件對金線蓮及其混偽品進行OPLS-DA分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗 取同一批(S15)供試品，按“1.2.2”項下方法制備，按“1.2.3”項下色譜條件連續進樣6次，以7號峰(水仙苷)為參照峰，測得16個共有峰相對保留時間RSD在0.04%～0.16%，相對峰面積RSD在1.06%～4.49%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復性試驗 取同一批(S15)供試品，按“1.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件測定，以7號峰(水仙苷)為參照峰，測得16個共有峰相對保留時間RSD在0.17%～0.52%，相對峰面積RSD在0.82%～4.64%，表明重復性良好。

2.1.3 穩定性試驗 取同一批(S15)供試品，按“1.2.2”項下方法制備，按“1.2.3”項下色譜條件于0、3、6、12、18、24 h測定，以7號峰(水仙苷)為參照峰，測得16個共有峰相對保留時間RSD在0.17%～1.02%，相對峰面積RSD在0.76%～4.99%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 金線蓮指紋圖譜的建立及共有峰的鑒定 按“1.2.2”項下方法制備17批供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件測定，得到17批金線蓮樣品HPLC指紋圖譜，見圖2。將其全部導入《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統軟件》(2012版)，設定S15為參照圖譜，采用中位數法，時間窗為0.3，多點矯正后生成共有模式圖，共確定16個共有色譜峰。通過與對照品圖譜對照，指認其中11個色譜峰，即峰2為槲皮素3,7-二葡萄糖苷、峰3為異鼠李素-3-O-蕓香糖-7-O-葡萄糖苷、峰4為蘆丁、峰5為異槲皮苷、峰6為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、峰7為水仙苷、峰8為紫云英苷、峰9為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷，峰11為槲皮素、峰13為山柰酚、峰14為異鼠李素，以分離度較好、峰面積較大且保留時間適中的7號峰(水仙苷)為參照峰，分別計算17批金線蓮的共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2～3。

2.槲皮素3,7-二葡萄糖苷；3.異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O葡萄糖苷；4.蘆丁；5.異槲皮苷；6.山柰酚-3-O-蕓香糖苷；7.水仙苷；8.紫云英苷；9.異鼠李素-3-O-葡萄糖苷；11.槲皮素；13.山柰酚；14.異鼠李素圖2 金線蓮的HPLC指紋圖譜及其16個共有峰

表2 17批金線蓮共有峰的相對保留時間

表3 17批金線蓮共有峰的相對峰面積

2.2.2 金線蓮指紋圖譜相似度評價 以17批樣品指紋圖譜共有模式為對照，計算各批次樣品相似度，結果見表4。S14～S17和S9的相似度為在0.851～0.899之間，其余批號相似度均大于0.9。

表4 17批金線蓮與對照指紋圖譜的相似度

2.2.3 指紋圖譜識別金線蓮混偽品 按“1.2.2”項下方法制備金線蓮7種混偽品的供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件測定，得到相應樣品的HPLC圖譜，并和17批次金線蓮得到的對照指紋圖譜一起全部導入《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統軟件》(2012版)，設定金線蓮對照指紋圖譜為參照圖譜，采用中位數法，時間窗為0.3，進行全峰匹配后計算相似度，結果見表5和圖3～4。

表5 金線蓮混偽品的相似度

S18～S25.臺灣銀線蘭；S26～S27.長片金線蘭；S28～S29.滇越金線蘭；S30～S31.麗蕾金線蘭；S32～S47.血葉蘭；S48～S51.大花斑葉蘭；S52～S53.虎耳草圖3 金線蓮對照指紋圖譜與混偽品HPLC圖譜

A.金線蘭；B.臺灣銀線蘭；C.長片金線蘭；D.滇越金線蘭；E.麗蕾金線蘭；F.血葉蘭；G.大花斑葉蘭；H.虎耳草圖4 金線蓮及其偽品對照指紋圖譜

2.3 聚類分析 以16個共有峰峰面積為變量，將金線蓮及其混偽品的峰面積導入SPSS 20.0軟件，選擇平方歐式距離為測度進行聚類分析，結果見圖5。當分類距離為16時，可分為2類，金線蓮聚為一類(S1～S17)，混偽品聚為一類(S18～S53)。金線蓮17批次中S1和S5～S14聚為一類(距離12)，然后與批次S15～S17聚為一類(距離15)，最后與批次S2～S4聚為一類(距離16)；混偽品中虎耳草(S52～S53)的距離最遠，與血葉蘭(S32～S47)、臺灣銀線蘭批次(S20、S21、S24、S25)、臺灣銀線蘭批次(S18、S19、S22、S23)聚為一類(距離5)，然后和麗蕾金線蘭(S30～S31)聚為一類(距離7)，進一步與大花斑葉蘭(S48～S51)聚為一類(距離8)；長片金線蘭(S26～S27)和滇越金線蘭(S28～S29)聚為一類(距離10)。

圖5 金線蓮及其混偽品聚類分析樹狀圖

2.4 主成分分析 主成分分析是在盡可能保持原有數據信息的前提下，通過降維處理達到簡化指標的計量學方法。將所有樣品的16個共有峰峰面積導入SPSS 20.0軟件，進行主成分分析，結果見表6～7和圖6。由表6可知，提取特征值大于1的3個成分，其方差的累積貢獻率為79.82%，表明這3個成分能夠代表16個指標在這批樣品中大部分的信息。由圖6可知，樣品被明顯分為兩類，一類為金線蓮，另一類為金線蓮的混偽品。載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻越大，由表7可知，峰7(水仙苷)、峰8(為紫云英苷)、峰9(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷)和峰12在主成分1上有較高的載荷(載荷絕對值大于0.9)，該結果與相似度評價、聚類分析結果基本一致。

表6 主成分分析特征值與貢獻率

表7 旋轉后公共因子載荷矩陣

圖6 主成分得分圖

2.5 OPLS-DA分析 正交偏最小二乘判別分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)是一種有監督的判別分析統計方法。將金線蓮及其混偽品的16個共有峰峰面積導入SIMCA-P14.1軟件，進行OPLS-DA，獲得相應模型。

圖7 OPLS-DA得分散點圖(A)和VIP圖(B)

2.6 差異標志物驗證 采用HPLC法對所有批次的金線蓮及其混偽品進行差異標志物峰7(水仙苷)的含量測定[33]，結果見表8、圖9。

圖8 OPLS-DA模型置換驗證圖

表8 金線蓮與混偽品的水仙苷含量

圖9 金線蓮及其混偽品的差異標志物含量

3 討論

3.1 指紋圖譜條件優化 在金線蓮混偽品中，大花斑葉蘭[34]和金線蓮同屬植物齒唇蘭[27]及興仁金線蓮[28]的指紋圖譜研究已有相關報道，實驗前期分別采用相同的液相條件對金線蓮和混偽品供試品進行分析，結果部分色譜峰未能較好分離、后期基線漂移嚴重。因此對其色譜條件進行優化，考察Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Welch Ultimate AQ-C18(4.6 mm×100 mm,3 μm)；Welch Ultimate Polar-RP(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×150 mm,2.7 μm)；Waters XSelect HSS T3(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)等6根不同的色譜柱，在相同的液相條件下Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)能夠將各目標峰均分離開，且分離度較好，最終優選Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相通過比較甲醇-水，甲醇-0.1%甲酸水，乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水，結果表明乙腈-0.1%甲酸水最佳；檢測波長，經DAD全波長圖譜對比，同時考慮基線，發現360 nm下峰容量大，圖譜平穩，因為選擇檢測波長為360 nm。

3.2 金線蓮及其混偽品指紋圖譜分析 通過比較金線蓮混偽品與金線蓮對照指紋圖譜的相似度發現，所有混偽品的相似度均在0.8以下，其中與金線蓮同屬植物的臺灣銀線蘭、長片金線蘭、滇越金線蘭和麗蕾金線蘭的相似度在0.072～0.765，其他的混偽品血葉蘭、大花斑葉蘭和虎耳草的相似度均在0.2以下。通過比較各混偽品與金線蓮的16個共有峰發現，臺灣銀線蘭與金線蓮的差異主要在臺灣銀線蘭無峰4(蘆丁)、峰5(異槲皮苷)、峰6(山柰酚-3-O-蕓香糖苷)、峰8(紫云英苷)、峰13(山柰酚)和峰14(異鼠李素)；麗蕾金線蘭和金線蓮的差異主要在其無峰1、峰2(槲皮素3,7-二葡萄糖苷)、峰3(異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O葡萄糖苷)、峰8(紫云英苷)、峰10、峰11(槲皮素)、峰12、峰13(山柰酚)和峰14(異鼠李素)；滇越金線蘭和金線蓮的差異主要在其無峰1、峰2(槲皮素3,7-二葡萄糖苷)、峰5(異槲皮苷)、峰8(紫云英苷)、峰9(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷)、峰10、峰11(槲皮素)、峰12、峰13(山柰酚)和峰14(異鼠李素)；長片金線蘭和金線蓮的差異主要在其無峰5(異槲皮苷)、峰8(紫云英苷)、峰9(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷)、峰10、峰11(槲皮素)、峰12、峰13(山柰酚)和峰14(異鼠李素)；血葉蘭與金線蓮相比，血葉蘭中僅含有峰6(山柰酚-3-O-蕓香糖苷)和峰7(水仙苷)，且含量極低，其他14個峰均不含有；大花斑葉蘭與金線蓮相比，16個共有峰中僅含有峰4(蘆丁)；虎耳草與金線蓮相比，16個共有峰均不含有。

從聚類分析結果可以看出虎耳草科的虎耳草距離最遠，與混偽品蘭科血葉蘭屬血葉蘭聚成一類，并且這一類中也包括了蘭科開唇蘭屬的臺灣銀線蘭，然后與開唇蘭屬的麗蕾金線蘭(S30～S31)聚為一類(距離7)，再與蘭科斑葉蘭屬的大花斑葉蘭(S48～S51)聚為一類(距離8)，最后與開唇蘭屬的長片金線蘭(S26～S27)和滇越金線蘭(S28～S29)聚為一類(距離16)，從混偽品的聚類來看，與金線蓮比較接近的混偽品為長片金線蘭(S26～S27)和滇越金線蘭，該結果與相似度的評價結果也互相吻合，同時與以往的指紋圖譜研究相比[23,28]血葉蘭、臺灣銀線蘭、斑葉蘭確實從本次的結果來看確有明顯的區分，不同于金線蓮。因此指紋圖譜的聚類分析結果提示不同基原的混偽品成分與金線蓮不一致，食用或藥用均建議應予以區分使用

3.3 金線蓮及其混偽品的PCA和OPLS-DA分析 經化學計量學聚類分析，分類距離為16時即分為2類，金線蓮聚為一類，混偽品聚為一類，與相似度結果基本一致；經化學計量學PCA的分析前3個主成分方差的累積貢獻率為79.82%，3個主成分分別為水仙苷、紫云英苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷；經化學計量學正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，經VIP統計，篩選出1個差異標志峰，為水仙苷，并對其含量進行測定驗證，金線蓮中水仙苷含量顯著高于其混偽品。17批次金線蓮的水仙苷含量在1 098～1 528 μg·g-1，8批次臺灣銀線蓮則僅3批次含有水仙苷，其水仙苷含量在15～50 μg·g-1，長片金線蘭的水仙苷含量在356.67～360.41 μg·g-1；滇越金線蘭的水仙苷含量在281.29～286.56 μg·g-1；麗蕾金線蘭的水仙苷含量在378.75～379.96 μg·g-1；16批次血葉蘭中10批未檢測到水仙苷，其余6批含量在132～208 μg·g-1；大花斑葉蘭水仙苷含量在29.23～36.04 μg·g-1，虎耳草中未檢測到水仙苷。

綜上，本研究采用HPLC指紋圖譜結合相似度評價以及化學計量學的方法對金線蓮及其混偽品進行鑒別，并篩選出差異標志物水仙苷，該方法能夠較好地區分金線蓮的7種混偽品：臺灣銀線蓮、長片金線蘭、滇越金線蘭、麗蕾金線蘭、血葉蘭、大花斑葉蘭和虎耳草，為金線蓮的質量控制提供參考。