牛黃鎮驚丸中黃曲霉毒素殘留檢測方法研究

劉雅丹,李靜,張聿梅,王菲菲,于欣

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

動物源性或植物源性中藥在生長、加工、貯藏和運輸過程中均可能被真菌污染[1]。其中，黃曲霉是我國糧食和飼料中常見的真菌，它的次生代謝產物黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)，具有致癌、致畸、致突變和強烈的肝臟毒性[2-4]。黃曲霉毒素B1(AFB1)是目前毒性最強、分布最廣、含量最高的Ⅰ類致癌物，它可以通過食物鏈在生物體之間轉移，對人類健康產生了嚴重的危害[4]。中藥材主要來源于天然產物，不可避免地會感染黃曲霉。一般認為，動物源性中藥材受潮霉變的概率高于植物源性中藥材[2]。因此，檢測動物源性中藥材或含動物源性中成藥中黃曲霉毒素的殘留量，對于確保臨床用藥安全至關重要。在《中國藥典》2015年版(一部)中，陳皮、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎、僵蠶等20余味藥材及其飲片均有黃曲霉毒素的檢查項，其要求為： AFB1含量不得超過5 μg·kg-1,B1、B2、G1和G2總含量不得超過10 μg·kg-1[7]。

牛黃鎮驚丸(大蜜丸)是一種常見的中成藥制劑，收載于《中國藥典》年版2015年版(一部)，處方由牛黃、全蝎、炒僵蠶、天麻、鉤藤、防風、膽南星、制白附子、天竺黃、薄荷和甘草等十八味中藥材原料組成，臨床主要治療小兒驚風，高熱抽搐，煩躁不安等癥狀[7]。本文針對牛黃鎮驚丸中動物源性和植物源性中藥材進行黃曲霉毒素檢測，評估牛黃鎮驚丸的黃曲霉毒素殘留的風險。

目前針對中藥中黃曲霉毒素檢測的方法，主要為薄層色譜法、免疫親和柱-高效液相色譜方法(IAC-HPLC)、液相串聯質譜法(HPLC-MS)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)等[1,5]。然而，這些方法操作較為復雜，需要專業的實驗室和操作人員完成試驗。為了適應現場快速檢查的需要，本文采用免疫膠體金方法(GICA)對牛黃鎮驚丸樣品的黃曲霉毒素的殘留量進行快速篩查。GICA方法可以在非實驗室條件下簡單快速地檢測樣品中真菌毒素的殘留量，已在食品和飼料行業得到了廣泛的應用[9]。

本文采用GICA方法對8批次牛黃震驚丸中黃曲霉毒素的殘留量進行測定，采用IAC-HPLC方法對測定結果進行確認。試驗通過對牛黃震驚丸樣品的前處理方法進行優化，降低了樣品本底對GICA方法和IAC-HPLC方法的干擾。試驗對測定方法的適用性進行確認，為中藥復方制劑黃曲霉毒素測定提供了技術支持。

1 儀器與試藥

Waters e2695分析型高效液相色譜儀，包括Waters 2475 熒光檢測器 (美國Waters公司)；光化學衍生器(美國AURA公司,反應線圈15 m，燈管254 nm)。Cloversil C18反相色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；AE 240 型十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler 公司)；Z2064 離心機(德國Hermle公司)；IAC-SEP黃曲霉毒素總量免疫親和柱；iCheck食品安全定量快檢儀；iCheck總黃曲霉毒素定量快檢試劑盒(中藥，產品號：CS101-J)、黃曲霉毒素混合標準品，均購自北京中檢維康技術有限公司；甲醇、乙腈(美國Thermo Fisher公司，色譜純)；樣品處理及溶液配制中使用的超純水由Mini-Q超純水處理系統制備(美國Millipore公司)。牛黃鎮驚丸及處方藥材和飲片均為市售。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 混合對照溶液 精密吸取黃曲霉毒素混合標準品(黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2標示濃度分別為1.0、0.3、1.0和0.3 μgmL-1)0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.1.2 供試品溶液 GICA法：取牛黃鎮驚丸樣品(用手術剪剪碎成約2 mm3塊狀)，稱取5.0 g于50 mL離心管中，加入70%甲醇溶液25.0 mL，置于旋轉搖床上旋轉振蕩提取10 min，用定性濾紙過濾，即得。

HPLC法取牛黃鎮驚丸樣品(用手術剪剪碎成約2 mm3塊狀)，稱取粉末樣品15 g置于均質瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min(11 000 r·min-1)，離心5 min(2 500 r·min-1)，精密量取上清15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻(稀釋試驗中，精密量取上清15 mL，置250 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻)。用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，量取續濾液20.0 mL，通過免疫親和柱，流速3 mL·min-1，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置于2 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 檢測方法 GICA法：從試劑盒中取出相應定量快檢卡和黃曲霉毒素稀釋緩沖液，平衡至室溫，將快iCheck食品安全定量快檢儀自帶的零點校正片插入定量快檢儀測定室，進行“零點校正”；將使用相應批次的快檢卡二維碼輸入到iCheck食品安全定量快檢儀中，獲取校準曲線。將外包裝打開，取出相應微孔固定于微孔架上，快檢卡放置于37 ℃恒溫器上。取黃曲霉毒素稀釋緩沖液120 μL于相應微孔中，加入供試品溶液30 μL，用移液器吸打5次混勻，取100 μL加入快檢卡樣品孔中。37 ℃反應10 min后，立即將快檢卡放入定量快檢儀中，點擊“檢測分析”讀數，即為樣品實際濃度。

IAC-HPLC法：色譜條件：采用Cloversil C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm)，以甲醇-水(45∶55)為流動相，流速0.8 mLmin-1，檢測器為熒光檢測器，激發波長λex=360 nm，發射波長λem=440 nm，進樣量20 μL，光化學衍生化系統為光化學衍生器 (連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器)。

2.3 樣品測定

2.3.1 GICA方法學驗證及樣品測定

2.3.1.1 空白對照 按處方量配置不含全蝎和炒僵蠶的牛黃震驚丸空白樣品，按照“2.1.2” 項下GICA法提取，即得，空白對照在GICA方法中無黃曲霉毒素檢出。

2.3.1.2 隨行回收率試驗 抽取3個批次樣品進行方法學驗證，編號為A、B和C，使用標準加入法，在供試品溶液中加入黃曲霉毒素B1標準品至終濃度分別為0、5、10、20 μg·kg-1的測試溶液。按“2.2”項下GICA法進行測定，每批次樣品平行重復3次，結果見表1。其中B和C 2份樣品本底有少量黃曲霉毒素B1檢出，含量不高于中國藥典限量。樣品回收率在96.8%～130.2%之間，其余批次樣品均無黃曲霉毒素檢出。

表1 GICA法檢測牛黃鎮驚丸中黃曲霉毒素回收率試驗結果(n=3)

2.3.2 IAC-HPLC方法學驗證及樣品測定 采用隨行質量控制(包括隨行空白試驗和隨行回收率試驗)確認方法的適用性。

2.3.2.1 檢測限 取混合對照溶液，進樣量2 μL，計算黃曲霉毒素B1峰信噪比為10，本試驗檢測限為黃曲霉毒素B10.4 μg·kg-1，黃曲霉毒素總量0.4 μg·kg-1。

2.3.2.2 空白對照 按處方量配置不含全蝎和炒僵蠶的牛黃震驚丸空白樣品，按照“2.1.2”項下 IAC-HPLC法提取，即得，空白對照在IAC-HPLC方法中無黃曲霉毒素檢出。

2.3.2.3 隨行回收率試驗 將A、B和C 3批次樣品，使用標準加入法，在供試品溶液中加入黃曲霉毒素B1標準品至終濃度分別為0、5、10、20 μg·kg-1的測試溶液。按“2.2”項下 IAC-HPLC法進行檢測，每批次樣品平行重復3次，計算黃曲霉毒素B1回收率結果見表2。3份樣品回收率在46.6%～67.7%之間。所有樣品未檢出B1、B2、G1和G2黃曲霉毒素。

表2 IAC-HPLC方法檢測牛黃鎮驚丸中黃曲霉毒素回收率試驗結果(n=3)

2.3.3 樣品稀釋的IAC-HPLC方法學驗證和黃曲霉毒素檢測 由“2.3.2”項下可知，采用IAC-HPLC方法對直接進樣的牛黃鎮靜丸樣品黃曲霉毒素含量進行檢測，結果表明A、B和C 3份樣品的回收率均較低。分析原因，可能是由于復方制劑成分復雜，本底干擾較為嚴重，使得測定結果回收率下降。試驗中將樣品進行梯度稀釋，結果發現在提取樣品時采用5倍稀釋時，本底干擾明顯降低。本節對稀釋后的供試樣品進行方法學研究。

2.3.3.1 檢測限 結果同“2.3.2.1”項下。

2.3.3.2 空白對照 結果同“2.3.2.2” 項下。

2.3.3.3 線性關系的考察 精密吸取混合對照溶液2、4、6、8、10和20 μL，注入HPLC色譜儀，記錄色譜圖。以AFB1濃度(ngmL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=0.656X-0.436,r2=0.998 1。AFB1在4～20 ngmL-1之間線性關系良好。

2.3.3.4 精密度試驗 精密吸取同一混合對照溶液，重復進樣6次，每次進樣10 μL，記錄色譜峰面積，精密度RSD在0.98%～1.55%之間，表明本試驗儀器精密度良好。

2.3.3.5 重復性試驗 取同一牛黃震驚丸樣品，按供試樣品溶液制備方法重復檢測6次，記錄色譜圖，計算RSD為0.20%，表明本方法重復性良好。

2.3.3.6 回收率試驗 將A、B和C 3批次樣品，使用標準加入法，在供試品溶液中加入AFB1標準品至終濃度分別為0、5、10、20 μg·kg-1的測試溶液。按“2.2”項下IAC-HPLC法進行檢測，每批次樣品平行重復3次，計算AFB1回收率結果見表3。3份樣品回收率在80.7%～94.0%之間。所有樣品未檢出B1、B2、G1和G2黃曲霉毒素殘留。

表3 IAC-HPLC法檢測牛黃鎮驚丸中黃曲霉毒素回收率試驗結果(×5)(n=3)

①A樣品加入黃曲霉毒素B1標準品至終濃度為5 μg·kg-1；②A樣品稀釋后加入黃曲霉毒素B1標準品至終濃度為5 μg·kg-1；③A樣品；④G1、B1、G2和B2黃曲霉毒素標準溶液圖1 牛黃鎮靜丸中黃曲霉殘留檢測HPLC圖

3 討論

本試驗采用了GICA和IAC-HPLC方法，對牛黃鎮驚丸的黃曲霉毒素殘留進行檢測，僅GICA方法中檢出2批次樣品有黃曲霉毒素AFB1殘留，且均低于試劑盒定量限(檢出限：1 μgkg-1，定量限：3 μgkg-1)。8批次樣品黃曲霉毒素殘留量符合《中國藥典》黃曲霉毒素限量規定。由于動物源性中藥材全蝎和僵蠶容易感染黃曲霉，本文使用去除全蝎和僵蠶的樣品作為空白對照。為了排除輔料的干擾，本文前期試驗也對各種蜂蜜(包括棗花蜜、桂花蜜和白花蜜等)和煉蜜進行考察，所有蜂蜜IAC-HPLC檢測無任何信號檢出，表明蜂蜜對免疫膠體金反應沒有干擾。

采用IAC-HPLC方法對牛黃震驚丸進行檢測時發現，樣品回收率較低，不能滿足黃曲霉毒素殘留測定的要求。分析可能的原因為牛黃震驚丸復方制劑中藥原料藥所含成分對IAC-HPLC測定結果有一定的干擾性。試驗表明，用對牛黃震驚丸樣品進行前處理中進行5倍稀釋，可明顯提高待測樣品的回收率。采用IAC-HPLC方法檢測樣品，8批次樣品均無黃曲霉毒素殘留檢出。中藥復方制劑成分復雜，可能干擾測試結果，應根據不同復方制劑的特點對檢測方法進行改進，并進行方法學確認。GICA方法和 IAC-HPLC方法結果基本一致，表明這兩種方法在牛黃震驚丸黃曲霉毒素殘留檢測中結果具有可比性。