食用柿果后形成“胃柿石”的風險分析

彭進明，陳多多，李凱凱，王瑞豐，張亞杰，李春美

1.華中農業大學食品科學技術學院/教育部環境食品學重點實驗室，武漢 430070；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣州 510225

結石是由消化物在胃腸道中形成的，依據其組成，大致可分為四類：植物性結石、毛發性結石、藥物性結石和混合性結石[1]。其中，植物性結石最為常見，它是由果蔬中難消化的纖維素、單寧和木質素組成[2]。結石患者的一般臨床癥狀包括腹痛、大便呈柏油狀、上消化道出血、甚至腸梗阻等[3]。柿子(DiospyroskakiL.)作為一種溫帶水果原產于中國，年產量約325萬t(2019年)，占全球總產量的76%(http://www.fao.org/faostat/zh/#data/QC)。柿果富含單寧、維生素C、類黃酮、膳食纖維和類胡蘿卜素等，具有抗氧化、抗輻射和抗肥胖等生物活性[4]。然而，柿子富含單寧這一特征似乎符合了結石的形成條件之一，這使得公眾聯想到食用柿子易得結石，人們對于食用柿子的這種擔憂嚴重制約了柿產業的發展。

目前“柿結石”成因主要有2種說法：其一，柿單寧易自聚集且極易與蛋白質結合，蛋白質與柿單寧強相互作用形成的沉淀物[5]就是“柿結石”；其二，未成熟的柿子含有大量的可溶性單寧，而這些單寧會在酸性環境中聚合形成膠狀的凝結物，該凝結物可以附著在胃中的纖維素、半纖維素和蛋白質上，從而誘發結石[6]。然而，這些說法僅來自于描述性臨床報告，缺乏全面和系統的評估。此外，一些報道稱植物性結石的病患存在柿子攝入史[7-8]，但關于“柿結石”的詳細化學成分，以及健康人群攝食柿子與“柿結石”的直接因果關系，目前尚無科學報道。

因此，本研究探討柿單寧是否會誘導結石形成，以及攝食柿果的胃結石風險，旨在為評估健康成人食用柿子的胃結石風險提供科學見解，并為公眾食用柿子提供健康指導。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

饅頭、米飯、雞蛋和雞肉均購自華中農業大學博園食堂；成熟的柿子采自廣西恭城，于-20 ℃下保存，以制備柿單寧和柿粉。

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、胃蛋白酶分析試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；胃蛋白酶購自Sigma-Aldrich；藥用稀鹽酸購自信陽化學試劑廠；奧美拉唑膠囊購自阿斯利康制藥有限公司；所有分析純試劑均購自國藥控股化學試劑有限公司。

1.2 樣品制備

可溶性柿單寧：稱取250 g柿子，60 ℃下用80%丙酮(每次2 L，重復3次)經100 W超聲提取30 min，合并濾液(濾渣用于提取不溶性柿單寧)，濃縮后凍干。

不溶性柿單寧：濾渣于60 ℃下用1%的鹽酸-甲醇(每次2 L，重復3次)經100 W超聲提取30 min，合并濾液，濃縮后凍干。

柿子粉：將冷凍的柿子切成片，經冷凍干燥后用粉碎機粉碎即得。

1.3 體外模擬胃消化研究

1)柿單寧-食品成分復合物的制備。參考美國藥典[9]略作修改配制模擬胃液(SGF)，將胃蛋白酶溶于0.2%的無菌氯化鈉溶液，最終質量濃度為3.2 g/L，然后用無菌0.1 mol/L鹽酸將pH值調節至1.2、1.8和3.5。將4種食物成分(大豆分離蛋白、酪蛋白、明膠、卵磷脂)、2種柿單寧(可溶性、不可溶性柿單寧)、果膠和纖維素溶于超純水，最終質量濃度均為2 mg/mL。

模擬胃消化的方法：將2 mL柿單寧、2 mL各食物成分、5 mL SGF(pH=1.8)和1 mL超純水在玻璃容器中混合，并在37 ℃振蕩孵育1 h獲得柿單寧-食物成分復合物。采用濁度法和透射電鏡分析復合物。

制備柿單寧-食物成分-果膠-纖維素的混合物：將1 mL可溶性單寧、0.5 mL各食物成分、2 mL SGF(pH=1.2或3.5)、0.5 mL果膠和0.5 mL纖維素置于玻璃杯中，37 ℃振蕩孵育1 h。不添加果膠和纖維素制備的復合物為對照組。

2)柿果-食物混合物的制備。將柿果和食物(饅頭、米飯、雞蛋和雞肉)壓碎，揉成糊狀。對于每個消化試驗，各樣品稱質量并混合，在孵育前添加預熱好的SGF(37 ℃，pH=1.2或3.5)。分組設置如下：對照組(10 g柿果置于200 mL超純水)，柿果組(10 g柿果置于200 mL SGF)，不同食物加柿果組(5 g不同食物加5 g柿果置于200 mL SGF)。立即將混合后的樣品在37 ℃(50 r/min)的振蕩水浴中孵育48 h。每種混合樣品均制備3份。

3)透射電子顯微鏡。在Formvar-碳涂層的銅網上滴加20 μL單寧或柿單寧-食物成分復合物溶液30 s。將樣品用0.8%的磷鎢酸(pH=7.0)進行負染色30 s，室溫下風干。透射電子顯微鏡(Hitachi H-7650)以120 kV的加速電壓分析樣品。

4)沉淀分析。根據沉淀速率反映柿單寧-食物成分-果膠-纖維素復合物的聚集水平。稱量混合樣品(W1)，然后以8 000 r/min離心5 min。將沉淀物在90 ℃下干燥至恒質量(m2)，試驗重復3次，沉淀率按(m2/m1)×100%計算。最后，將每種沉淀物分成三等份，每等份沉淀物分別與SGF溶液、可口可樂和5% NaHCO3溶液混合。混合物于37 ℃水浴中以50 r/min振蕩孵育24 h，然后觀察其溶解情況。

1.4 體內動物試驗

1)實驗動物與分組。選用8周齡Sprague-Dawley大鼠(SD，180 g，雌雄各半)，購買于湖北省實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(鄂)2015-0018。飼養在溫度(22±3) ℃，相對濕度(50±3)%，明暗周期12 h的環境下，自由飲食飲水。適應7 d后，將大鼠隨機分為6組(每組20只，雄雌各半)，分組信息如下：(1)對照組(基礎飲食：50.75%的碳水化合物，4.14%的脂肪，20.34%的蛋白質，其中12%的熱量源于脂肪)；(2)高蛋白組(基礎飲食補充5%的大豆分離蛋白粉)；(3)柿果組(基礎飲食補充10%的柿子粉)；(4)高蛋白+柿果組(飼喂柿果飲食并添加5%的大豆分離蛋白)；(5)高酸+柿果組(飼喂柿果飲食，每日灌胃1%稀鹽酸)；(6)低酸+柿果組(飼喂柿果飲食，每日灌胃4 mg/kg奧美拉唑)。在這項研究中，根據標準體質量公式換算，SD大鼠日攝入的10%柿粉(2.5 g)相當于健康成人每日食用2個柿果(約500 g)。整個試驗期間，所有動物自由飲食飲水。30 d后，處死大鼠，解剖并收集胃部樣品。從腹主動脈采集血液，并通過離心(12 000 r/min，15 min，4 ℃)獲得血清。所有樣品置于-80 ℃保存待測。該研究獲得了華中農業大學實驗動物中心的倫理學批準。

2)血液常規檢查，血液生化檢查和抗氧化活性分析。采用Sysmex XT-2000i血液分析儀(Sysmex Corp，日本)檢測血常規，HITACHI 7020自動生化分析儀測量血清生化指標。參考文獻[10]方法，分析血清抗氧化水平(T-SOD、MDA、CAT和GSH-Px)。

3)胃功能分析和組織學檢查。收集胃內容物，4 000 r/min(4 ℃，10 min)離心。測定胃液pH值，按試劑盒方法測定胃蛋白酶活性。組織學檢查的方法如下：用10%福爾馬林固定胃組織過夜，然后用石蠟包封。將包裹石蠟的組織切片，固定并用蘇木精-伊紅(H&E)染色。然后，采用光學顯微鏡放大400倍觀察樣品并采集視野。

1.5 志愿者試驗

50名健康的成年志愿者(男女各半，年齡在18～45歲)參加了為期30 d(2017年10月10日-2017年11月8日)的柿子食用試驗。所有志愿者知情并同意參與，該研究獲得了華中科技大學同濟醫學院的倫理學批準。志愿者被要求每天吃2個柿子(共計400～500 g)，持續30 d。在此期間，記錄各志愿者的每日飲食情況。要求志愿者報告任何類似于結石的癥狀，包括腹部脹痛、惡心、嘔吐、食欲不振、消化不良、反酸、嘔血和便血等。一旦出現以上癥狀，立即就醫，借助內窺鏡診斷志愿者胃中是否形成結石。

1.6 典型產區的柿子消費調查

問卷調查于2017年10月9日-2017年10月31日進行。在柿子產區(廣西恭城)開展隨機調查，參與群體包括農民、水果商家、林業局工作人員和胃腸病專家。調查表中涉及消費者的喜好、習慣以及他們對胃結石的認識程度。

1.7 統計分析

試驗數據以“平均值±標準差”表示，并通過GraphPad Prism 5.0的one-way ANOVA分析數據，Tukey多重檢驗分析組間差異，P<0.05時認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 模擬胃液模型中“柿結石”形成的風險

單寧與蛋白質的強結合作用被認為是“柿結石”的根本原因，首先考察了不同蛋白質與柿單寧的絮凝潛力。如圖1所示，混合體系的濁度隨著各種食物成分(大豆分離蛋白、酪蛋白、明膠、卵磷脂)的添加而增加。單寧-食物成分復合物的濁度隨反應時間的延長而增加，并在30 min時保持穩定。這些結果表明不同食物成分均可與柿單寧形成聚集體。相比不溶性柿單寧，食物成分(除明膠外)與可溶性柿單寧形成復合物的濁度更大，這表明可溶性單寧更易與食物成分發生絮凝。不同食物成分與柿單寧的絮凝潛力分別為：對于可溶性柿單寧,卵磷脂>大豆分離蛋白>明膠>酪蛋白；對于不溶性柿單寧,卵磷脂>明膠>酪蛋白>大豆分離蛋白。

柿單寧(SPT：可溶性柿子單寧；IPT：不溶柿子單寧)與不同食物成分(SPI：大豆分離蛋白；CA：酪蛋白；GE：明膠；LE：卵磷脂)混合，37 ℃水浴中孵育1 h，每隔10 min測定1次濁度。Samples were prepared by incubating the persimmon tannins (SPT：Soluble persimmon tannin; IPT：Insoluble persimmon tannin) in a shaking water bath at 37 ℃ for 1 h with various food ingredients (SPI：Soy protein isolate; CA:Casein; GE：Gelatin; LE：Lecithin),the turbidity was measured every 10 min.圖1 柿單寧在模擬胃液中與大豆分離蛋白(A)、酪蛋白(B)、明膠(C)和卵磷脂(D)的絮凝趨勢Fig.1 The flocculation trend of persimmon tannin with soy protein isolate(A), casein(B),gelatin(C),and lecithin(D) in simulated gastric juice

接著，我們評估了果膠及纖維素對柿單寧與食物成分絮凝的影響。如圖2所示，添加果膠和纖維素后可溶性單寧和食物成分的絮凝水平顯著提高(P<0.05)，這表明果膠和纖維素會加速柿單寧與食物成分的絮凝。此外，我們還考察了不同胃酸條件下可溶性單寧和食物成分二者絮凝的影響。如圖2所示，在高酸(pH=1.2)和低酸(pH=3.5)條件下，可溶性單寧與幾種食物成分(大豆分離蛋白、酪蛋白和明膠)互作形成的沉淀無顯著差異(P>0.05)。

PE & CE為果膠和纖維素；與對照組(CON)相比，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001；## P<0.01，不同pH值下對照相比。PE & CE represents pectin and cellulose; *P < 0.05,**P < 0.01,and ***P < 0.001 versus control group (CON); ## P<0.01,pH=1.2 control vs. pH = 3.5 control.圖2 果膠-纖維素和胃酸水平對大豆分離蛋白(A)、酪蛋白(B)、明膠(C)和卵磷脂(D)與柿單寧絮凝的影響Fig.2 Effects of pectin-cellulose and gastric acid levels on the flocculation of soluble persimmon tannin with soy protein isolate(A),casein(B),gelatin(C) and lecithin(D)

我們進一步借助透射電鏡觀察由可溶性單寧與各種食物成分互作所得沉淀的形態，結果如圖3所示。可溶性/不可溶性單寧不僅能通過自組裝形成大而致密的團聚體，而且還能通過與食物成分交聯形成大顆粒單寧-食物成分聚合物，其中，單寧與食物成分形成的聚集體明顯比單寧自聚集形成的聚集體疏松。

A：可溶性柿單寧和可溶性柿單寧-食物成分復合物； B：不溶性柿單寧和不溶性柿單寧-食物成分復合物。柿單寧(SPT：可溶性柿子單寧； IPT：不溶柿子單寧)在37 ℃的水浴中孵育1 h，不使用或與各種食物成分(SPI：大豆分離蛋白；CA：酪蛋白； GE：明膠； LE：卵磷脂)。A:The soluble persimmon tannin and tannin-food ingredient complexs; B:The insoluble persimmon tannin and tannin-food ingredient complexs.Samples were prepared by incubating the persimmon tannins (SPT:Soluble persimmon tannin; IPT:Insoluble persimmon tannin) in a shaking water bath at 37 ℃ for 1 h without and with various food ingredients (SPI:Soy protein isolate; CA:Casein; GE:Gelatin; LE:Lecithin).圖3 單寧和單寧-食物成分復合物的TEM圖像Fig.3 TEM images of tannins and tannin-food ingredient complexs

此外，我們還選擇了模擬胃液(SGF)、可口可樂和5%NaHCO3溶液分別處理絮凝物，分析它們是否符合結石的溶解特性。結果顯示，可溶性柿單寧與不同食物成分形成的所有沉淀物均被模擬胃液充分溶解，但不能被可口可樂或5%NaHCO3溶液溶解。

2.2 在動物模型中評價持續攝入柿子后“柿結石”的形成風險

我們根據報道所述的胃結石誘因設計了不同的柿果干預組，進一步評估“柿結石”的形成風險。首先我們檢查了連續30 d攝食柿子后SD大鼠的胃內容物，直接判斷攝食柿果是否會引起胃結石。結果顯示，所有大鼠的胃中均未觀察到結石。

接著，通過考察胃液pH值和胃蛋白酶活性來評估柿果攝入對大鼠胃分泌功能的影響。如表1所示，正常胃酸水平下，連續30 d攝入柿果(柿果組)未引起胃pH值顯著變化(P>0.05，相對于對照組)。然而，與對照組相比，稀鹽酸處理(高酸+柿果組)后胃液pH值顯著(P<0.05)降低。此外，奧美拉唑干預后(低酸+柿果組)胃液pH值顯著(P<0.05)增加。在正常胃酸環境下(柿果組，高蛋白+柿果組)，連續30 d攝入柿果不會引起胃蛋白酶活性顯著(P>0.05，相比于對照組)變化。胃酸異常(高酸+柿果組，低酸+柿果組)則會導致胃蛋白酶活性異常。這些結果表明，健康大鼠持續30 d攝入柿果不會對其胃分泌功能造成不利影響。同時，稀鹽酸或奧美拉唑干預會引起胃分泌功能障礙。

采用H&E染色觀察柿果攝入后大鼠胃組織的病理學變化，結果如圖4所示。除高酸+柿果組外，其他組中大鼠的胃組織沒有發現明顯變化。暴露于高酸環境后，胃組織的病理學特征完全改變。在高酸+柿果組中，胃黏膜上皮局部脫落，淋巴細胞浸潤，血管擴張和充血。這表明在正常胃酸環境下，攝食柿果對胃組織無明顯影響，而高酸刺激會損傷胃黏膜。

圖中箭頭所指視野即胃組織的病理變化區域。The arrow in the picture indicated the pathological changes in gastric tissues.圖4 不同處理方法對胃組織病理變化的影響Fig.4 Effects of different treatments on pathological changes of gastric tissues

此外，我們還檢查了攝入柿果對血液參數的影響(數據未列出)。結果顯示所有參試大鼠的各項指標均在健康范圍內[11]，這表明連續30 d攝入柿果后，受試動物的生理狀況穩定。此外，攝入柿果后大鼠有較高的血清抗氧化水平(表1)，尤其是GSH-Px水平。

表1 不同處理方法對SD大鼠血清抗氧化水平的影響Table 1 Effects of different treatments on serum antioxidant levels of SD rats

動物實驗結果表明，連續攝入柿果30 d后，SD大鼠胃內容物中未發現結石。此外，在正常大鼠中，膳食補充柿果后，其胃分泌功能和胃病理特征并沒有明顯變化。柿果攝入后受試動物的生理狀況保持穩定。根據這項研究中大鼠的每日柿果攝入量，經推算可知，健康成人每日食用2個柿果(400～500 g)不會引起胃結石。

2.3 志愿者試驗及柿子產地調查

對50名健康成年志愿者進行公開試驗，評估他們連續攝入柿果30 d后的胃結石風險。試驗結束后，所有志愿者的體質量沒有明顯變化。其中2名志愿者食用柿子后感到輕微脹氣，這可能是他們自身消化不良引起，將脆柿換成更易消化的軟柿后再無不適表現。在整個試驗期間，志愿者每天連續食用2個新鮮柿果(400～500 g)，沒有出現明顯不適感或結石癥狀。

廣西恭城是我國柿子主產區，柿果消費量大。本研究采用問卷結合訪談對當地柿子消費情況進行調查，結果顯示200名參與者均無結石病史，受訪者男女基本各半，年齡分布較廣。其中，98%的受訪者持續食用柿果超過30 d，將近一半的人更喜歡飽腹食用柿果。同時，85.5%的人每天至少食用2個柿果。另外，98.5%的受訪者在食用柿子后未感到不適，1.5%的受訪者出現輕微腹部脹氣，沒有典型的結石癥狀。

3 討 論

長期以來，食用柿子是否會導致胃結石這一問題飽受爭議，公眾對于食用柿子的擔憂嚴重制約了柿產業的發展。然而，到目前為止，并無系統的研究證實食用柿子會引起結石。一些文獻[12-13]報道“柿結石”的形成涉及多種因素，包括食物成分、單寧、胃酸環境、果膠和纖維素。研究發現，對于可溶性柿單寧和不溶性柿單寧，其絮凝能力的強弱順序分別為：卵磷脂>大豆分離蛋白>明膠>酪蛋白；卵磷脂>明膠>酪蛋白>大豆分離蛋白。相比不溶性柿單寧，可溶性柿單寧與食物成分形成的復合物濁度更大；胃酸環境變化對可溶性柿單寧與食品成分產生絮凝的影響較小，而添加果膠和纖維素后可溶性柿單寧和食物成分的絮凝度提高。

為判斷本試驗中得到的絮凝物是否是結石，首先我們采用透射電鏡觀察了單寧-食物成分絮凝物的形貌特征，發現單寧-食物成分絮凝物為疏松多孔狀，這與Iwamuro等[14]報道中“柿結石”具有堅硬狀態的描述完全不同。此外，Ladas等[15]報道可樂能成功治療結石，碳酸氫鈉溶液對植物性結石也有較好的療效，我們進一步考察了這些絮凝物在胃蛋白酶、可口可樂和5% NaHCO3中的溶解能力。結果發現絮凝物均能被模擬胃液溶解，但不能被可樂或5% NaHCO3溶液溶解。這表明盡管柿單寧易與食物成分形成絮凝物，但它們都可被消化酶分解，這與結石的溶解特性不符。趙貝塔等[13]認為，模擬胃液中柿單寧與食物成分形成的絮凝物就是“胃柿石”，這是武斷的、不科學的。綜上所述，柿單寧與食物蛋白的絮凝能力并不意味著其結石形成風險。

在動物體系中，30 d連續攝食柿果后大鼠胃內容物均未發現結石。此外，我們評估了不同條件下(高蛋白飲食，高/低胃酸干預)攝食柿果后SD大鼠的胃結石形成風險。血常規和血生化檢測顯示所有受試大鼠的血液參數均在標準范圍內，這表明食用柿果后大鼠保持健康狀態。此外，本研究分析了在不同飲食條件下柿果對胃分泌功能的影響，結果表明在正常胃酸條件下食用柿果后不會影響胃分泌功能，而高/低胃酸環境會導致胃分泌異常。另外，胃組織病理學檢查發現，除高胃酸+柿果組外，其他實驗組均無明顯病理變化。此外，研究結果顯示，柿果作為膳食來源具有較強的體內抗氧化活性[16]，這與本實驗室前期報道一致。客觀來說，大鼠和成人攝入柿果的方式不同，人和實驗動物的體質量、血容量等存在差異，這些都是本研究的局限之處，但考慮到大鼠和成人的消化系統較為類似，一定程度上對于評估“胃柿石”風險同樣具有參考價值。后續可以從臨床角度關注柿果食用史的結石患者，根據相關醫學報告進行大數據統計和關聯性分析，綜合評估食用柿果后形成“胃柿石”的風險。

柿果食用期間，僅2名志愿者感到脹氣，這可能是消化不良引起，所有志愿者均沒有典型的胃結石癥狀。產地調查顯示，所有受訪者均表示食用柿果后無典型的結石癥狀。有少數病例報告稱，植物性結石歸因于患者的柿果攝入史，此說法雖有一定的依據，卻忽略了患者的胃腸道病史。據臨床資料報道，腹部手術后患者的胃動力下降，更易形成結石[17]。另外，植物性胃結石形成是一個復雜的病理過程，涉及到眾多風險因素包括慢性胃炎、胃腸道癌和糖尿病等相關疾病[18]。因此，診斷結石時只關注柿子的攝入，這無疑是不全面的、不科學的。后續試驗可考慮建立胃排空障礙或胃功能缺陷的大鼠模型，進一步探究特定人群攝食柿果的胃結石風險。

盡管單寧具有絮凝和結合蛋白質的特性，但本研究表明，柿單寧與食物成分互作形成的絮凝物與報道中的“柿結石”形態完全不同，且這些絮凝物在模擬胃環境中能被充分消化。因此，單寧與食物成分的絮凝作用并不意味著其“柿結石”的形成風險。在動物實驗中，連續攝食柿果30 d后，SD大鼠胃內未發現結石，且胃分泌功能及胃病理學指標正常。此外，在典型柿子產區進行志愿者試驗和問卷調查，均未出現吃柿子得結石的病例。總的來說，我們認為健康成人每日食用2個柿子(400～500 g)不會導致胃結石。本研究將為公眾客觀地認識柿子，科學地食用柿子提供參考依據。