益腎化濁方對快速老化P8小鼠學習記憶能力及精神行為影響*

于 臻，程汝珍，張 偉，吳 丹，張琳琳

（1.天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津 300120；2.天津中醫藥大學，天津 301617；3.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）以進行性記憶減退及其他認知功能障礙、精神行為異常和日常生活能力下降為主要臨床癥狀[1]，90%于65歲以后發病，是最常見的癡呆原因[2]。目前我國AD患者超過1 000萬，是全球AD患者數量最多的國家[3]。前期研究發現，益腎化濁方可有效改善輕度AD患者臨床癥狀[4]。在此基礎上，本研究選取3月齡SAMP8小鼠作為研究對象，旨在觀察益腎化濁方對其學習記憶能力及精神行為的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級3月齡雄性SAMP8小鼠20只，體質量20～25 g，3月齡雄性抗快速老化小鼠（senescence-accelerated-resistant mouse-1，SAMR1）小鼠10只，體質量20～25 g，均由天津中醫藥大學第一附屬醫院提供。飼養于天津市南開醫院實驗動物中心，明暗交替12 h/12 h，室溫23～25℃，相對濕度為50%～60%，自由攝食與飲水。實驗過程中所有操作遵循《實驗動物管理與使用指南》[5]。

1.2 藥物與主要儀器 益腎化濁方組成：女貞子10 g，淫羊藿 10 g，肉蓯蓉 10 g，制何首烏 6 g，石菖蒲6 g，川芎6 g，一次性購于天津中醫藥大學第二附屬醫院中藥房。為保證灌胃期間藥物的穩定性[6]，便于保存同時利于質量控制，將上述中藥飲片提取濃縮、真空冷凍干燥后制成中藥復方凍干粉，于陰涼干燥處密封保存備用。

旋轉蒸發儀（鄭州英峪予華儀器有限公司，RE-201D），原位凍干機（無錫沃信儀器有限公司，VS-502FD），Morris水迷宮視頻分析系統（北京眾實迪創科技發展有限責任公司ZS-001），ANY-maze動物行為分析系統（美國Stoelting公司）及曠場實驗檢測箱，高架十字迷宮實驗視頻分析系統（北京眾實迪創科技發展有限責任公司，ZS-DSG）。

1.3 分組及干預 將20只SAMP8小鼠隨機分成模型（SAMP8）組、益腎化濁方（YSHZ）組各 10只，10只SAMR1小鼠作為對照組。各組小鼠進行灌胃干預：YSHZ組予以益腎化濁方，模型組和對照組予以蒸餾水。YSHZ組給藥劑量參考《藥理實驗方法學》[7]中體表面積法，根據人（70 kg）與小白鼠（20 g）之間0.002 6的折算系數進行計算，按患者每日服用益腎化濁方生藥48 g，則20 g小鼠每日生藥量為0.124 8 g，即生藥6.24 g/kg，將上述益腎化濁方中藥復方凍干粉用蒸餾水配成相應濃度的藥液。各組小鼠每日灌胃1次，持續12周。

1.4 Morris水迷宮 灌胃結束后參照Vorhees等[8]實驗方案，向水迷宮的圓形水池中注入清水使水深達30 cm，加入黑色復配著色劑使水呈現為不透明的黑色，水溫控制在21～22℃。將黑色的目標平臺隱藏于第一象限水面下1 cm，以進行定位航行實驗。

1.4.1 定位航行實驗 每天每只小鼠進行4次檢測，共持續5 d。小鼠入水后，系統自動跟蹤記錄數據。若小鼠在65 s內登上平臺，則系統自動停止記錄，逃避潛伏期時間即為記錄時間；若超過65 s，則逃避潛伏期時間系統自動記錄為65 s，同時引導小鼠到平臺上停留10 s。

1.4.2 空間探索實驗 定向航行實驗結束后次日將水池中平臺移除，每只小鼠檢測1次，從平臺對側位置即第三象限內投放，系統自動跟蹤記錄小鼠入水后65 s內穿越平臺區域的次數。

1.5 曠場實驗 將小鼠放于清潔的方形曠場實驗檢測箱內，使用ANY-maze動物行為分析系統進行數據采集，以記錄5 min內各只小鼠的活動總距離及進入中心區域的次數。每次小鼠測試結束后，均用酒精充分擦拭檢測箱以防小鼠間氣味或者臟物的干擾。

1.6 高架十字迷宮 參照Walf等[9]實驗方案，將小鼠置于儀器中開放臂和封閉臂的連接處，面朝實驗者對側的開放臂，用高架十字迷宮實驗視頻分析系統記錄其5 min內的活動情況，并計算其在開放臂內停留時間的比例。同曠場實驗，在每次測試后用酒精擦拭儀器，待其揮發后再進行下只小鼠測驗。

1.7 統計方法 采用SPSS 19.0統計分析軟件進行處理，正態分布數據計量資料以均值、標準差（）表示；多組間比較采用方差分析，連續變量的比較采用重復測量的方差分析。非正態分布數據計量資料以中位數、四分間距M（IQR）表示，組間比較采用非參數Kruskal-Wallis檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 益腎化濁方對SAMP8小鼠學習記憶能力的影響

2.1.1 平均游泳速度 各組小鼠5 d的游泳速度數據采用重復測量方差分析，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明各組間小鼠體能情況基本相同，可排除游泳速度對逃避潛伏期的影響。見表1。

表1 各組小鼠游泳速度估算的邊際均值比較（±s）

表1 各組小鼠游泳速度估算的邊際均值比較（±s）

分組 n 平均游泳速度/cm·s-1）SAMR1 組 10 18.65±1.04 SAMP8 組 10 16.85±1.09 YSHZ 組 10 17.69±1.04

2.1.2 逃避潛伏期 各組小鼠5 d逃避潛伏期時間比較采用重復測量方差分析，經Mauchly球形檢驗（P＜0.05），采用 Greenhouse-Geisser進行校正，結果顯示：時間因素P＜0.05，說明各組小鼠的逃避潛伏期均隨時間的變化而變化，且時間與分組因素存在交互作用（P＜0.05），說明不同組的逃避潛伏期不相等。事后多重比較結果顯示：與SAMR1組相比，SAMP8組及YSHZ組小鼠逃避潛伏期均顯著延長（P＜0.05）；與SAMP8組相比，YSHZ組小鼠避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠逃避潛伏期估算的邊際均值比較（±s）

表2 各組小鼠逃避潛伏期估算的邊際均值比較（±s）

注：與SAMR1組比較，*P＜0.05；與SAMP8組比較，#P＜0.05。

分組 n 逃避潛伏期/s SAMR1 組 10 32.57±1.49 SAMP8 組 10 56.52±1.49*YSHZ 組 10 39.01±1.49*#

2.1.3 穿越平臺次數 經Kruskal-Wallis檢驗，結果顯示：與SAMR1組相比，SAMP8組小鼠穿越平臺次數顯著減少（P＜0.05），而YSHZ組與之相比差異無統計學意義（P＞0.05）；與 SAMP8組相比，YSHZ組小鼠穿越平臺次數明顯增加（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠穿越平臺次數比較（M（IQR））

2.2 益腎化濁方對SAMP8小鼠精神行為的影響

2.2.1 曠場實驗結果 經單因素方差分析發現：與SAMR1組小鼠相比，SAMP8組小鼠活動總距離及進入中心區域次數均顯著減少（P＜0.05），而YSHZ組與之相比差異無統計學意義（P＞0.05）；與SAMP8組相比，YSHZ組小鼠活動總距離及進入中心區域次數均顯著增加（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠曠場實驗結果比較（±s）

表4 各組小鼠曠場實驗結果比較（±s）

注：與SAMR1組比較，*P＜0.05；與SAMP8組比較，#P＜0.05。

分組 進入中心區域次數SAMR1 組 17.50±5.72 n 10 SAMP8 組 5.00±2.97*10 YSHZ 組 16.33±4.18#10總距離（m）7.32±0.99 2.34±1.50*5.62±0.67*#

2.2.2 高架十字迷宮結果 經單因素方差分析發現：與SAMR1組小鼠相比，SAMP8組和YSHZ組小鼠在開放臂停留時間的占比均顯著減少（P＜0.05），但與SAMP8組相比，YSHZ組小鼠在開放臂停留時間的占比無統計學差異（P＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠高架十字迷宮結果比較（±s）

表5 各組小鼠高架十字迷宮結果比較（±s）

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0.05。

分組 n 開放臂停留時間比例/%SAMR1 組 10 51.54±20.19 SAMP8 組 10 9.88±5.82*YSHZ 組 10 18.12±0.31*

3 討論

AD屬祖國醫學“健忘”“癡呆”等病證范疇[10]，其根本病機在于腎虛，兼有痰瘀濁邪[11]，因此采用益腎化濁法以切中肯綮。該法由著名中醫腦病專家張伯禮院士提出，課題組成員在傳承其經驗及研究成果的基礎上，結合多年的臨床實踐和專家建議，以法組方并進行了優化。益腎化濁方由6味中藥組成，方中女貞子并制首烏以增滋腎陰之功，淫羊藿合肉蓯蓉以強溫腎陽之力，4藥合用以于“陰中求陽，陽中求陰”；石菖蒲豁痰開竅、川芎活血行氣，使津液得布、氣血通利。美國國立老化研究所和阿爾茨海默病協會強調AD的病理改變在其臨床癥狀出現前15～20年就已經開始，因此早期干預對于預防或延緩其進一步發展具有重要意義。

快速老化小鼠（SAM）[12]是日本ToshioTakeda教授在京都大學研發，并由天津中醫藥大學第一附屬醫院的韓景獻教授引進入我國[13]，其中SAMP8小鼠是目前公認的研究衰老和AD的動物模型[14]。隨著月齡的增加，雄性SAMP8小鼠不僅行為活動減少、反應下降，外觀上皮膚毛發欠光澤、晦暗、粗糙，并出現脫毛、皮膚潰瘍、眼睛損害和脊柱后凸的老化征象及情緒失調、晝夜節律紊亂等[15-16]，且伴增齡性學習記憶能力障礙[17]。研究顯示，SAMP8小鼠4月齡出現早期學習和記憶障礙[18]，5月齡時已出現焦慮抑郁相關的精神行為異常[19]。而中醫認為衰老的出現與腎虛密切相關[20]，故SAMP8小鼠是進行本研究的理想模型。

行為學評價是衡量動物學習記憶能力及其精神行為的主要標準[21]。Morris水迷宮是評價動物學習記憶的經典方法[22]，利用動物厭惡水而被迫游泳、學習尋找水中隱藏平臺的本能進行檢測。涉及兩大經典實驗：一是定向航行實驗，主要用于考察動物的空間學習記憶能力，其中，動物找到隱匿平臺所需的時間為逃避潛伏期，該時間的長短與實驗動物的學習記憶能力成反比；二是空間探索實驗，主要反映動物對空間記憶的維持能力[23]。曠場實驗和高架十字迷宮則是研究動物精神行為的常用測試，前者用于分析小鼠活動和焦慮樣行為[24]，小鼠受到壓力時在曠場中的活動減少，而其焦慮程度較低時更傾向于在曠場的中央區域活動；后者利用嚙齒動物對保護區域如封閉臂的偏好及探索新環境的天性之間的矛盾來考察其焦慮狀態，在開放臂中停留時間越長顯示其焦慮程度較低。

本次研究結果顯示，Morris水迷宮實驗中各組小鼠在游泳速度無顯著差異的前提下，與SAMR1組小鼠相比，SAMP8組小鼠逃避潛伏期時間明顯增加，表現出一定的學習記憶障礙；在空間探索實驗中，與SAMR1組相比，SAMP8組小鼠的穿越平臺次數顯著減少，說明該小鼠對于前5d的學習記憶保持較差；而經過益腎化濁方干預后，SAMP8小鼠逃避潛伏期時間明顯縮短，穿越平臺次數也顯著增加，提示益腎化濁方能有效改善SAMP8小鼠早期學習記憶能力減退。曠場實驗和高架十字迷宮結果顯示，與SAMR1組相比，SAMP8組小鼠總運動距離、進入中心區域次數及在開放臂停留的時間比例顯著減少，提示SAMP8小鼠的精神行為異常；在使用益腎化濁方干預后，SAMP8小鼠總運動距離和進入中心區域次數均顯著增加，在開放臂停留的時間比例有增加的趨勢，但尚未達到統計學差異，表明益腎化濁方具有一定的抗焦慮作用，考慮進一步擴大實驗樣本量予以確認。

綜上所述，益腎化濁方可有效改善SAMP8小鼠早期學習記憶能力減退及精神行為異常，今后將進行具體機制的探索。