桂枝調和營衛配伍對類風濕關節炎模型大鼠炎癥及骨破壞的影響*

彭代平，湯小虎，李東云，丁 喆，周瑞彬

（1.云南中醫藥大學第三附屬醫院，云南 昆明 650011；2.云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650021）

桂枝是發散風寒藥，性溫，具有調和營衛、溫通經脈、散寒止痛的功效。前期文獻研究[1]發現桂枝廣泛用于治療痹病的名方中，同時實驗研究[2-3]也發現桂枝溫通經脈相關配伍對膠原關節炎大鼠模型的血清促炎性因子有下調作用。類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）發病的主要病機是本虛標實，氣血虧虛，陰陽失調，營衛失和，風寒濕熱邪外侵，經絡痹阻而致，營衛氣血失和是類風濕關節炎發病的重要環節[4-6]，故在治療RA時調和營衛很重要。本研究選取桂枝調和營衛配伍組合干預風寒濕痹型類風濕關節炎模型大鼠，觀察其對促炎性細胞因子及骨破壞的影響，探討其防治RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性Wistar大鼠80只，體質量（200±20）g，購自成都達碩生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（川）2014-028。于云南省中醫醫院中心實驗室SPF級動物房飼養，環境溫度（21±3）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環至實驗結束，飼養期間大鼠可自由獲取潔凈飲用水和食物，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 主要藥物與試劑 甲氨喋呤片（2.5 mg，批號：036130413），上海信誼藥廠有限公司；桂枝配方顆粒（0.5 g相當生藥重 3 g，批號：1306175），白芍配方顆粒（1 g相當生藥重 10 g，批號：1307089），赤芍配方顆粒（1.5 g相當生藥重 10 g，批號：1307070），當歸配方顆粒（4 g相當生藥重 10 g，批號：1309148），熟地配方顆粒（4 g相當生藥重 10 g，批號：1309107），均為江陰天江藥業有限公司產品；牛Ⅱ型膠原購自四川大學；完全弗氏佐劑（BD 公司，貨號：263810）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒（BD公司，貨號：558535），IL-6檢測試劑盒（BD 公司，貨號：550319），IL-1β 檢測試劑盒（R&D 公司，貨號：RRA00）。

1.3 主要儀器 Biofuge Primo R離心機（德國Thermo Scientific Heraeus公司）；酶標儀（美國BioTeK公司）；分析天平（METTLER TOLEDO公司）；電子秤（上海友聲衡器有限公司）；YLS-7B足趾容積測量儀（濟南益延科技發展有限公司）；光學顯微鏡（LEICA DM2500）。

1.4 造模及給藥 將80大鼠隨機選取正常組10只，其余70只建立風寒濕痹CIA模型；將100 mg牛Ⅱ型膠原溶于20 mL（0.1 mol/L）的醋酸中，置于4℃過夜，再與等容積的完全弗氏佐劑混合，制備Ⅱ型膠原終濃度為2.5 mg/mL的混合物，然后用注射器反復抽吸，直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散為度；取乳化后的混合物，于麻醉的大鼠尾根、背部皮內各注射0.1 mL，并壓迫注射部位30 s使乳化物吸收完全。正常組給予同等劑量的生理鹽水皮內注射。免疫后第14天，參照文獻[2]并改進，模擬自然風寒濕環境，建立RA風寒濕痹模型，將造模大鼠置于（7±3）℃冷水中，水深1 cm中站立30 min，同時伴以4～5級風力，每天1次，連續刺激7 d。于免疫后第21天進行關節炎指數評分（AI），AI≥2分即為造模成功[7-8]，并隨機分為模型組、桂枝白芍組、桂枝赤芍組、桂枝當歸組、桂枝熟地組、甲氨喋呤組，每組10只。根據臨床常用劑量（桂枝20 g，白芍20 g，赤芍20 g，當歸20 g，熟地30 g）按“人和大鼠之間體表面積折算”等效劑量灌胃給藥，即每天給藥量：桂枝白芍組3.6 g/kg，桂枝赤芍組3.6 g/kg，桂枝當歸組3.6 g/kg，桂枝熟地組4.5 g/kg；甲氨喋呤組1.5 mg/kg，每周給藥1次；空白組和模型組給予蒸餾水灌胃；給藥容積為1 mL/100g，連續給藥21d。

1.5 觀察及檢測指標

1.5.1 觀察大鼠體質量變化 從分組給藥當日開始測量體質量，每1周測量1次。

1.5.2 觀察大鼠關節炎指數（AI）評分 于給藥前及給藥7、14、21d各進行1次AI評分，評價方法參照文獻[9]。0分：無紅斑或腫脹；1分：輕微的紅斑和1個趾關節腫脹；2分：紅斑和超過1個趾關節的腫脹；3分：紅斑和踝部或腕部腫脹；4分：全部紅斑以及腳趾和踝部或手指和腕部的腫脹，踝或腕不能彎曲。四肢評分之和（最高分為16分）為AI，分值越高代表關節炎程度越嚴重。

1.5.3 測量大鼠足爪容積 使用YLS-7B足趾容積測量儀測量大鼠雙后足爪容積并于踝關節處標記，給藥前及給藥7、14、21 d各進行1次大鼠雙后足爪容積測量，并采用（雙后足爪容積之和/2）計算出每1只后爪的容積。

1.5.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的測定 給藥21 d，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血并處死大鼠，待血液凝固后，置離心機于4℃，3 500 r/min，離心10 min后分裝血清，采用ELISA法（按試劑盒說明書程序進行操作）檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量。

1.5.5 大鼠踝關節病理變化 大鼠處死后，取雙后肢踝關節，于10%中性緩沖福爾馬林進行固定，浸洗、脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋、切片后蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察踝關節的病理變化。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析，數據均以均數±標準差（±s）表示，符合正態分布的計量資料組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD法分析，方差不齊的資料采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組體質量變化比較 分組給藥前，與正常組比較，模型組和各給藥組大鼠體質量較輕，差異有統計學意義（P＜0.01），但各給藥組與模型組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥 21 d時，模型組及各給藥組大鼠體質量低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01），各給藥組與模型組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；從體質量增長情況來看，正常組大鼠體質量增長較模型組和各給藥組明顯，差異有統計學意義（P＜0.01），但模型組大鼠體質量增長較各給藥組緩慢，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組對大鼠體質量變化的影響（±s，g）

表1 各組對大鼠體質量變化的影響（±s，g）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

n 給藥前 給藥21 d 體質量增長10 387.90±30.49 443.70±35.30 55.80±13.84 10 319.40±32.62**348.60±36.01**29.20±7.76**桂枝白芍 10 320.67±35.98**360.61±42.56**39.94±8.85**##桂枝赤芍 10 324.40±28.94**363.85±37.10**39.45±8.75**##桂枝當歸 9 319.22±26.38**359.39±34.29**40.17±6.91**##桂枝熟地 10 317.25±30.77**358.75±34.37**41.50±8.00**##甲氨喋呤 10 329.50±40.92**373.80±49.38**44.30±12.92**##組別正常模型

2.2 各組大鼠AI比較 同正常組比較，模型組大鼠AI評分均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，給藥前及給藥7、14 d時各藥物組大鼠AI評分差異均無統計學意義（P＞0.05）；給藥21 d時，各給藥組大鼠AI評分均低于模型組，其中桂枝白芍、桂枝赤芍、桂枝當歸及甲氨喋呤組明顯低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。各給藥組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組CIA大鼠AI評分比較（±s，分）

表2 各組CIA大鼠AI評分比較（±s，分）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

n 給藥前 給藥21 d 10 0.00±0.00 0.00±0.00 10 5.90±2.42** 7.00±2.16**桂枝白芍 10 6.11±2.26 4.56±2.51#桂枝赤芍 10 5.80±2.35 4.40±2.17#桂枝當歸 9 5.78±2.82 4.56±2.55#桂枝熟地 10 5.80±2.53 4.70±2.45甲氨喋呤 10 5.70±2.83 4.50±2.55#組別正常模型給藥7 d 0.00±0.00 6.20±2.20**6.22±2.39 5.80±2.53 5.89±2.89 6.10±3.11 5.90±3.07給藥14 d 0.00±0.00 7.10±2.33**5.67±2.29 4.90±2.08 5.22±3.03 5.90±3.07 5.50±3.03

2.3 各組大鼠后爪容積比較 在給藥前及給藥7、14、21 d，模型組大鼠后爪容積均大于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）；給藥前各藥物組大鼠后爪容積與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥7、14 d時，各藥物組大鼠后爪容積較模型組有不同程度下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥21d時，各藥物組大鼠后爪容積較模型組明顯下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組CIA大鼠后爪容積比較（±s，mL）

表3 各組CIA大鼠后爪容積比較（±s，mL）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

n 給藥前 給藥21 d 10 1.97±0.06 2.20±0.08 10 2.99±0.80** 3.04±0.55**桂枝白芍 10 3.04±0.71 2.55±0.43#桂枝赤芍 10 2.96±0.59 2.57±0.37#桂枝當歸 9 2.94±0.85 2.54±0.45#桂枝熟地 10 2.92±0.74 2.48±0.34#甲氨喋呤 10 2.91±0.81 2.57±0.43#組別正常模型給藥7 d 2.06±0.07 3.00±0.75**3.02±0.57 2.86±0.62 2.92±0.81 2.86±0.68 2.79±0.72給藥14 d 2.13±0.07 3.06±0.61**2.78±0.56 2.73±0.50 2.75±0.65 2.58±0.41 2.67±0.56

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平較正常組明顯升高（P＜0.05或 P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；各給藥組大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（±s，pg/mL）

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

n TNF-α IL-1β IL-6 10 10.10±2.30 15.76±2.51 35.94±22.47 10 15.13±1.81** 19.87±3.06* 114.03±40.30**桂枝白芍 10 12.43±2.28# 18.81±4.01 57.54±14.61##桂枝赤芍 10 11.00±2.57## 19.39±4.48 59.48±29.41##桂枝當歸 9 12.54±2.93# 19.45±2.78 48.21±17.85##桂枝熟地 10 11.04±1.90## 17.27±4.01 39.61±12.47##甲氨喋呤 10 11.60±2.53## 18.19±3.86 49.48±18.65##組別正常模型

2.5 各組大鼠關節病理變化情況 正常組大鼠關節組織結構清楚完整，關節軟骨表面規則光華，軟骨細胞呈橢圓形，排列整齊；模型組可見關節滑膜細胞大量增生，大量炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞為主，關節軟骨及骨組織破壞，增生的纖維組織向骨髓腔內侵入生長；桂枝白芍、桂枝赤芍、桂枝當歸、桂枝熟地組可見少量成纖維樣滑膜細胞增生，關節面粗糙不規則，可見骨質破壞，炎癥細胞浸潤；甲氨喋呤組大鼠滑膜組織輕中度增生，軟骨細胞排列不整齊，關節軟骨層變薄，關節面粗糙，骨質破壞，有淋巴細胞和中性粒細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠關節病理變化HE染色（×200）

3 討論

類風濕關節炎是一種慢性以侵蝕性關節炎為主要特征的常見自身免疫病，其主要病理表現為滑膜炎、血管翳形成，逐漸出現關節軟骨和骨破壞，最終導致關節畸形和功能喪失[10]。雖然RA病因復雜，發病機制尚不完全明確，但促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6在驅動RA關節滑膜炎癥反應和關節破壞起關鍵的作用[11-13]。TNF-α、IL-1β 均可以激活 NF-κB通路，誘導血管血管細胞黏附因子（VCAM-1）、內皮生長因子（VEGF）等多種細胞因子生成，促進RA滑膜炎癥和血管翳的形成[14-15]。TNF-α和IL-1β通過上調核因子κB受體活化因子配體（RANKL）表達，促進破骨細胞生成，介導RA骨破壞[16-17]。IL-6主要是參與成纖維細胞的激活和增殖、破骨細胞分化等，可通過JAK/STAT3和WNT通路促進OC分化和抑制OB生成，導致RA骨破壞[18-19]。

RA屬于中醫“痹癥”“歷節風”“尪痹”等范疇。張仲景《金匱要略·中風歷節病脈證并治》提出：“榮氣不通，衛不獨行，榮衛慎微，三焦無所御，四屬斷絕，身體羸瘦，獨足腫大，黃汗出，脛冷。假令發熱，便為歷節也。”《類證治裁·痹證》載：“諸痹……良由營衛先虛，腠理不密，風、寒、濕乘虛內襲，正氣為內所阻，不能宣行，因而留滯，氣血凝澀，久而成痹。”《醫林繩墨》曰：“大率痹由氣血虛弱、榮衛不能和通，致令三氣乘于腠理之間?！笨梢姞I衛失和在痹證的發病中至關重要?，F代醫家國醫大師徐經世認為氣血不足、營衛失調是尪痹發生的重要內部原因[20]；姜泉教授認為尪痹之起，一則邪氣乘體虛侵入，二則營衛之氣不和[21]；馬文輝教授認為營衛傾移是類風濕關節炎的核心機制之一[22]?？傊盃I衛氣血失和”是RA發病的重要原因，在臨床中使用頻率較高前3味中藥有當歸、桂枝、白芍[23-25]，桂枝白芍、桂枝當歸配伍是較常用的配伍，也從側面證實了“調和營衛氣血”治療的重要性，特別是RA的早期。

桂枝味辛、甘，性溫，具有發汗解肌、溫通經脈、助陽化氣之功?！侗静菥V目》曰：“桂枝透營達衛，故能解肌而風邪去，脾主營，肺主衛，甘走脾，辛走肺也?！薄侗静莘纸洝分^：“桂枝溫經通脈，發汗解肌，調和營衛?！惫鹬π翜匕l散走表而入衛分，入衛則溫衛，甘溫走脾能通達血脈而入營分，入營則和營，故有調和營衛、溫通經脈之功。芍藥苦酸甘、微寒，歸肝脾二經，具有養血涼血，斂陰和營止痛的功效；與桂枝相合，一營一衛，一收一散，起到調和營衛、散風斂營和解肌發表之功。當歸甘、辛、溫，歸肝、心、脾經，其味甘而重，善于補血，其氣輕而辛，又能行血，補中有動，行中有補，為補血行血之要藥，具有養血活血、通補兼備、補虛祛瘀之功效；與桂枝配伍，溫中有補，補中有行，溫通行血，使血虛瘀滯，血得濡養，瘀滯得行，寒凝得溫則通，起到溫經通絡、調和氣血之功。熟地甘、微溫，歸肝、腎經，甘溫質潤，善滋補腎陰益精以生血，為滋陰養血補虛之要藥；與桂枝配伍，一陰一陽，一血一氣，溫潤宣通經脈，起到調和氣血陰陽、溫通養血之功。

本研究中桂枝與白芍、桂枝與赤芍、桂枝與當歸、桂枝與熟地配伍具有調和營衛氣血之功，對風寒濕環境刺激CIA模型大鼠體重增長和關節炎指數不同程度改善；桂枝調和營衛氣血配伍組合能明顯減輕CIA大鼠后足容積，抑制CIA大鼠血清炎性細胞因子TNF-α、IL-6的表達，發揮抗炎及減輕骨破壞，但其具體分子機制尚需進一步研究。