基于網絡藥理學探討益氣涼血生肌方預防冠心病PCI術后復發心絞痛機制*

魯婷婷，龍 佳，汪吳嬌，楊志飛，林 謙，萬 潔

（1.北京中醫藥大學 北京 100029；2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；3.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一種嚴重影響居民健康，甚至引起死亡的疾病。全球每年約有740萬患者死于CHD[1]。經皮冠狀動脈介入術（percutaneous coronary intervention，PCI）因能夠快速有效地開通血管恢復血運而降低冠心病病死率，被廣泛地運用于臨床。但隨著PCI術的普及，其導致的不良影響也逐漸顯現出來。臨床發現PCI術后患者靶血管常出現內皮細胞受損、炎癥反應及血栓形成等病理變化，進而引發復發心絞痛等術后不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）[2-3]。盡管患者在術后接受規律口服藥物治療，其復發心絞痛的概率仍可高達30%，而至于那些對口服藥物存在不可耐受的副作用以及嚴格禁忌證的患者，再發心絞痛概率可能會更高[3-4]。

基于對創傷修復理論的認識，針對PCI術后患者病理變化特點，首都國醫名師廖家楨教授創立了益氣涼血生肌方（YQLXSJF）用于PCI術后 MACE的臨床防治。課題組前期臨床研究表明PCI術后早期口服中藥YQLXSJF能夠有效減少心絞痛的復發[5]。本研究結合課題組前期成果，進一步運用網絡藥理學，擬通過篩選心絞痛與益氣涼血生肌方的共同靶基因，找到YQLXSJF防治CHD PCI術后復發心絞痛的可能機制，為YQLXSJF對PCI術后患者的臨床應用以及后續科學研究提供一定基礎。

1 資料與方法

1.1 藥物靶點篩選 YQLXSJF各味藥成分及相應靶點通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[6]（TCMSP）檢索，并限定兩個ADME屬性值：類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 與口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%[7-8]。并在 Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）獲取標準基因名。

1.2 藥物活性成分與靶點圖構建 通過cytoscape 3.7.1做出YQLXSJF“活性成分-靶點”圖，并在圖中用“節點”對二者進行表示，用“邊”表示二者關系，并通過“Network Analyzer”統計分析自由度（degree）等網絡拓撲參數，對二者之間的關系進行描述。

1.3 心絞痛相關靶點的篩選 以“angina”為關鍵詞，在 GeneCards 數 據 庫（https：//www.genecards.org）、OMIM 數據庫（https：//mirror.omim.org）中挖掘調治心絞痛的靶點，并在Uniprot數據庫中轉化成標準的基因名，合并2個數據庫靶點后建立疾病的靶標庫。在Genecards數據庫中，可根據Score＞中位數為篩選標準篩選疾病靶點[9]，刪除重復值后得到心絞痛相關靶點。

1.4 藥物和疾病共同靶點篩選 通過微生信在線平臺（http：//www.Bioinforma-tics.com.cn/）將 YQLXSJF化學成分靶點和心絞痛相關的疾病靶點進行映射，繪制Venn圖，獲得交集靶點。

1.5 蛋白質互作網絡（PPI）構建和關鍵靶點篩選運用 STRING11.0 數據庫（https：//www.string-db.org/）把將交集靶點提交至形成PPI網絡[10-11]，設置最小相互作用閾值為“highest confidence（0.700）”，選擇人類并對斷開的節點進行隱藏，將下載的tsv導入Cytoscape 3.7.1進行PPI作圖。采用CytoNCA插件，根據接近（Closeness Centrality，CC）、介數（Betweenness Centrality，BC）中心性以及自由度（Degree，DC）3 個主要參數進行拓撲篩選[12]，得到其核心靶點。

1.6 生物學功能和通路分析 使用Metoscape平臺[13]對核心靶點進行基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本體（GO）分析，并通過微生信在線平臺對結果進行可視化。

1.7 關鍵靶點-通路圖構建 應用Cytoscape 3.7.1構建核心靶點-信號通路圖，并進行網絡特征分析，得出YQLXSJF防治心絞痛的關鍵靶點和通路。

2 結果

2.1 藥物成分、靶點的篩選以及圖形構建 在TCMSP數據庫中共篩選出該方119種化學成分，其中黃芪20種，丹參65種，丹皮11種，金銀花23種；去除未查到靶點的成分，去重后共得到44種候選藥效成分（表1）。得到2 116個相關靶點，去重后有252個。各味藥物的成分與各成分對應靶點構成的網絡圖中共包括節點285個和相互關系735個（圖1）。

表1 YQLXSJF成分信息

續表1

圖1 YQLXSJF活性成分-靶點網絡圖

2.2 心絞痛靶點的獲取及交集靶點PPI構建GeneCards與OMIM數據庫得到的心絞痛靶點取并集，得到疾病靶點1 740個。疾病與藥物靶點取交集獲得166個共同作用靶點，此即YQLXSJF預防心絞痛有重要意義的靶點（圖2）。在STRING數據平臺輸入166個共同靶點，設置完成后下載Tsv文件，并導入到Cytoscape 3.7.1中得到一個由161個節點和1 415條邊組成的網絡（圖3A）。以DC、BC和CC中位數為篩選標準，取同時大于以上3個指標中位數的靶點作為第1次篩選結果，圖中共有節點55個和相互關系677個（圖3B）；第2次以大于2倍DC的中位數作為篩選標準，進一步篩選，得到257個相互作用和26個節點，將這些靶標作為YQLXSJF作用于心絞痛的核心靶點（圖3C）。26個核心靶點依次為：AKT1、TP53、MAPK8、IL6、MAPK1、TNF、VEGFA、JUN、STAT3、EGF、EGFR、CXCL8、MYC、MMP9、IL1B、CASP3、RELA、CCND1、FOS、PTGS2、APP、CCL2、ESR1、MAPK14、ICAM1、IL10（表2）。

圖2 心絞痛疾病靶點與YQLXSJF活性成分靶點韋恩圖

圖3 共同靶點PPI網絡圖

表2 YQLXSJF預防心絞痛核心靶點

2.3 核心靶點GO分析 在Metoscape數據庫中對藥物活性成分與疾病的26個共同核心靶標進行GO富集分析，得到分子功能（Molecular Function，MF）、生物過程（Biological Process，BP）以及細胞組分（Cellular Component，CC）的富集結果，如圖4所示BP方面，共同作用靶點在炎癥反應（inflammatory response）、DNA結合轉錄因子活性的調節（regulation of DNA-binding transcription factor activity）等較多；在CC方面，主要富集在膜微結構域（membrane microdomain）、膜筏（membrane raft）等；在 MF 方面，主要富集在轉錄因子結合（transcription factor binding）、信號受體激活因子的活性（signaling receptor activator activity）等。

圖4 富集GO term BP，CC，MF三合一柱狀圖

2.4 KEGG通路富集分析 在Metoscape數據庫中對藥物活性成分與疾病的26個共同靶標進行KEGG通路富集分析，選取Pvalue排名前20的通路進行可視化分析，得到KEGG通路富集分析圖（圖5）。共同靶點集中在糖尿病并發癥AGE-RAGE（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF（TNF signaling pathway）、IL-17 （IL-17 signaling pathway）以及流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）等，提示 YQLXSJF 作用于以上多條通路來預防PCI術后心絞痛的發生。

圖5 KEGG通路富集分析圖

2.5 關鍵靶點-通路網絡的構建 在KEGG分析中，將核心基因集中較多的通路和這些基因進行可視化分析（圖6）。基因用正方形表示，信號通路v形表示。共41個節點，221個相互關系。并進行特征分析，Degree值大小通過圖形大小表示。結果表明Degree值最大的為 RELA；其他如 MAPK14、MAPK1、MAPK8、TNF、IL1B、FOS、AKT1、IL6 等基因也具有較大的Degree值。這些靶基因可能是YQLXSJF預防心絞痛的核心靶標。

圖6 核心靶點-通路圖

3 討論

PCI是一把雙刃劍，一方面在緩解臨床癥狀的同時，另一方面也會引起血管損傷，短時間內導致平滑肌細胞快速增生遷移以及血栓形成，進而導致術后心絞痛等MACE的出現[14]。因此，在血管內膜創傷修復時，維持冠狀動脈血管穩態，對減少PCI術后再發心絞痛等MACE的發生具有重大意義。首都國醫名師廖家楨教授在中醫創傷修復理論的基礎之上結合臨床實踐，擬定益氣涼血生肌方YQLXSJF（黃芪、丹皮、丹參、金銀花）用于臨床，該方已獲得國家專利（ZL200810240175.4）。方中黃芪益氣托毒生肌，丹皮、丹參合用涼血活血、祛瘀生新，金銀花涼血祛瘀，重視補益正氣兼顧清除熱瘀之邪。前期臨床研究發現YQLXSJF降低PCI術后患者再狹窄率的趨勢、減少術后復發心絞痛等MACE的發生率[5]，改善遠期預后[15-16]。進一步在基礎實驗中發現YQLXSJF對球囊損傷術后兔頸動脈具有促進修復的作用，對VEC的增殖具有促進作用，同時能抑制VSMC的增殖和遷移，使血管內皮功能得以改善[17]。但PCI術后復發心絞痛的單獨作用機理缺乏整體闡述。本研究使用網絡藥理學方法整體分析YQLXSJF抗心絞痛的主要作用機制。

本研究通過在TCMSP數據庫初步篩選出候選藥效成分及靶點，再進一步借助軟件對YQLXSJF成分靶點信息進行網絡分析，從網絡圖中得到關鍵的藥效成分，其中山柰酚、槲皮素與木犀草素等黃酮類化合物Degree值排名靠前。YQLXSJF中大多數化合物會影響多個靶標。根據Degree值排名靠前的有山柰酚、槲皮素以及木犀草素等，這3種化合物率屬于黃酮類化合物，大量研究表明黃酮類化合物能夠清除體內過多的自由基并拮抗血小板活化因子，從而抑制VSMC增殖以及血管壁增厚[18]。一項大樣本臨床研究表明食用富含山柰酚、槲皮素以及木犀草素能夠明顯降低冠心病心絞痛的發生以及冠心病致死率[19]。山柰酚、槲皮素以及木犀草素調節了與心絞痛疾病相關的大多數靶標，均具有抑制VSMC增殖，且OB較高，因此，推測它們可能為YQLXSJF的代表性化合物。

YQLXSJF與心絞痛蛋白質相互作用核心網絡圖結果顯示，該方防治心絞痛的靶點主要集中在AKT1、TP53、MAPK8、IL6、MAPK1、TNF、VEGFA、JUN以及FOS等。AKT1主要是參與調節機的體炎癥反應、免疫調節以及新陳代謝等過程，為冠心病患者的重要的生物標記物及治療靶點[20]。MAPK1與MAPK8能夠參與調節細胞凋亡及炎癥等多種細胞反應[21]。JUN與FOS屬于兩種原癌基因，能夠調控IL-6、IL-1β的表達以及機體的炎癥反應。此外，研究表明Jun-Fos核蛋白復合物在心肌缺血、心肌梗死以及PCI術后管腔再狹窄等心血管疾病病理過程中起到重要作用[22]。學者劉婧瑋等研究發現IL6與TNF在冠心病血瘀證患者中存在高表達，這也佐證了YQLXSJF能夠用于冠心病PCI術后證型為血瘀的患者[23]。因此，推測這些靶點基因主要能夠通過調節炎癥反應、免疫、新陳代謝來預防冠心病心絞痛。

為進一步探討YQLXSJF潛在作用機制，KEGG分析結果發現的多條潛在信號通路中，流體剪切應力與動脈粥樣硬化，TNF、IL-17以及糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路相關性大。剪切應力是血流在血管壁內皮表面產生的摩擦力，在血管生物學中起著核心作用，并有助于心絞痛的發展。擾動的血流和相關的往復運動以及低剪切應力通常會上調內皮細胞基因和蛋白的表達，從而促進動脈壁的氧化和炎癥狀態，促進硬化斑塊的化生，最后發生心絞痛[24]。AGERAGE信號傳導涉及MAPKs以及蛋白激酶C的多個細胞內信號途徑的激活，然后影響NF-κB活性[25]。NF-κB可促進促炎因子（如IL-6和TNF-α）以及與心絞痛相關的基因VEGF表達。而VEGF能加快血管形成[26]。推測YQLXSJF可能通過以上等通路發揮防治PCI術后心絞痛的作用，前期對PCI術后復發心絞痛機制的研究與本研究結果基本一致[27-29]。除此之外，富集分析結果顯示YQLXSJF作用于心絞痛與炎癥反應、膜筏、轉錄因子結合等生物過程相關。未來可以從PCI術后剪切應力和炎癥反應等通路方面對涼血生肌方預防冠心病PCI術后復發心絞痛機制進一步驗證。

本研究運用網絡藥理學方法初步探究YQLXSJF預防冠心病PCI術后再發心絞痛的潛在作用機制，為YQLXSJF防治PCI術后復發心絞痛的臨床應用以及后續科學研究提供一定理論基礎。但由于網絡藥理學研究熱點的傾向性和數據庫信息完整性和準確性的限制，且藥物成分及其相應靶點數量有限，不能完全闡述中藥復方的藥理作用，且中藥從口服到代謝過程中，要經歷復雜的過程，故需后續代謝組學研究明確入血成分。為明確該方作用于心絞痛的主要靶點，仍需進一步細胞實驗驗證。