著絲粒蛋白F在非小細胞肺癌組織中的表達及其對A549細胞生物學行為的影響研究

常彥祥，孫利平，李斌

肺癌是最為常見的惡性腫瘤，其發病率、死亡率居各類惡性腫瘤之首，數據顯示，世界范圍內每年新發肺癌患者約有180萬人，占癌癥總新發患者人數的12.9%，死亡患者約有160萬人［1-2］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理類型，占肺癌的85%左右［3］。NSCLC患者早期癥狀多不明顯，確診時通常已發展為中晚期，錯失了最佳手術切除治療時機，且放化療的效果不佳，毒副作用嚴重，生存率通常處于4%～17%［4］。分子靶向治療是治療腫瘤的新手段，且尋找影響肺癌細胞生物學行為的分子標志物將有助于NSCLC的早期發現及有效治療。著絲粒蛋白F（centromere protein F，CENPF）是絲粒蛋白家族的重要成員，在細胞有絲分裂的調控過程中起重要作用［5］。既往研究表明，CENPF在膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中表達升高，其沉默可抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲過程，且與患者的不良預后密切相關［6-8］，但其對NSCLC細胞生物學行為的影響鮮有研究。本研究旨在分析CENPF在NSCLC組織中的表達水平，并探討其對A549細胞生物學行為的影響，以期為NSCLC的靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 癌組織與癌旁組織的收集 收集2018年10月—2019年10月于西安醫學院第一附屬醫院行外科切除手術的26例NSCLC患者的癌組織、癌旁組織標本。26例NSCLC患者中，男16例，女10例；年齡45～68歲，平均年齡（55.4±8.7）歲；鱗癌15例，腺癌11例；低分化16例，中高分化10例。所有癌組織經病理學檢測為NSCLC，癌旁組織經檢測無癌變。本研究通過西安醫學院第一附屬醫院倫理委員會審核通過，并取得患者簽署的知情同意書。

1.2 試劑與儀器 人NSCLC A549細胞（貨號：ZYH122）購自美國模式菌種收集中心（American type culture collection，ATCC）細胞庫；胎牛血清（貨號：FBS500-S）購自澳大利亞AusGeneX公司；RPMI-1640培養液（貨號：LS115-001）購自上海雙洳生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑（貨號：11668030）購自美國Life Technologies公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒（貨號：K1002S）購自美國Promega公司；陰性對照（negative control，NC）-干擾性小核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）、CENPF-siRNA、CENPF、GAPDH引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑（貨號：CK-04）購自日本同仁化學研究所；Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：YT131）購自北京百奧萊博科技有限公司；CENPF抗體、細胞周期蛋白D1（cyclinD1）抗體、B淋巴細胞瘤-2基因相關X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）抗 體、GAPDH抗 體（ 貨 號：ab264215、ab226977、ab263897、ab181602）購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G（貨號：0295G-HRP）購自美國Santacruz公司；恒溫培養箱（型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC）購自日本松下公司；qPCR儀（型號：ABI 7500）購自美國Applied Biosystems公司；酶標儀（型號：Stat Fax-2100）購自美國Awareness公司；流式細胞儀（型號：BD FACSCanto II）購自美國BD公司。

1.3 研究方法

1.3.1 Western blotting法檢測NSCLC組織、癌旁組織中CENPF表達水平 使用RIPA裂解液裂解NSCLC組織、癌旁組織，提取組織中總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白樣本與6×SDS上樣緩沖液混合加熱變性，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白質，并將其轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，采用5%脫脂奶粉封閉緩沖液1 h，TBST緩沖液洗滌，加入1∶500稀釋的一抗（CENPF抗體、GAPDH抗體），4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌，加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，化學發光法顯色、顯影，拍攝圖像，分析條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算CENPF表達水平。實驗獨立重復6次。

1.3.2 A549細胞培養與分組 將A549細胞培養于RPMI-1640培養基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液）中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養，2 d換液1次，根據細胞生長狀態，3～5 d傳代1次。取生長良好的對數期A549細胞，胰酶消化后調整密度為1×105個/ml，以100 μl/孔接種于96孔培養板中，將其分為對照組、陰性對照組、CENPF抑制組，其中對照組A549細胞不進行轉染處理，陰性對照組、CENPF抑制組A549細胞使用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染NC-siRNA、CENPF-siRNA。

1.3.3 qPCR法檢測A549細胞中CENPF mRNA表達水平 將1.3.2中處理后的各組細胞培養48 h，收集細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，檢測總RNA的純度、濃度，合格后將其反轉錄合成cDNA，按照qPCR試劑盒說明方法檢測CENPF mRNA表達水平。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s， 共 循 環40次。CENPF上 游 引 物 為：5'-TACAACGAGAGAGTAAGAACGC-3'，下游引物為：5'-CTACCTCCACTGACTTACTGTC-3'；內參GAPDH上游引物為：5′-CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC-3′，下游引物為：5′-ATGAAGTCAGAGGAGACCACCTG-3′。實驗獨立重復6次。

1.3.4 CCK-8法檢測A549細胞增殖情況 將1.3.2中處理后的各組細胞培養48 h，每孔加入CCK-8試劑10 μl，繼續培養4 h，在酶標儀波長450 nm處檢測吸光度（optical density，OD）值。實驗獨立重復6次。

1.3.5 流式細胞儀檢測A549細胞凋亡情況 將1.3.2中處理后的各組細胞培養48 h，收集細胞，加入Binding Buffer將細胞濃度調整為1×106個/ml，然后依次加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI，混勻，室溫下避光孵育1 h，在流式細胞儀上檢測A549細胞凋亡率。實驗獨立重復6次。

1.3.6 流式細胞儀檢測A549細胞周期 將1.3.2中處理后的各組細胞培養48 h，收集細胞，采用-20 ℃預冷的70%乙醇固定1 h，3 000 r/min離心10 min（離心半徑15 cm），洗滌，用500 μl RNase/PI將細胞重懸，避光染色20 min，在流式細胞儀上檢測A549細胞周期。實驗獨立重復6次。

1.3.7 Western blotting法檢測 A549細胞中 CENPF、cyclinD1、Bax表達水平 將1.3.2中處理后的各組細胞培養48 h，使用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣本變性，10% SDS-PAGE、轉膜、封閉1 h，TBST緩沖液洗滌，加入1∶500稀釋的一抗（CENPF抗體、cyclinD1抗體、Bax抗體、GAPDH抗體），4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌，加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，采用化學發光法顯色、顯影，拍攝圖像，分析條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算CENPF、cyclinD1、Bax表達水平。實驗獨立重復6次。

1.4 統計學方法 采用SPSS 24.0統計學軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以（x± s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數資料以絕對數表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織與癌旁組織中CENPF表達水平比較NSCLC組織中CENPF表達水平為（0.92±0.09），高于癌旁組織的（0.43±0.08），差異有統計學意義（t=9.968，P＜0.001），見圖1。

2.2 三組A549細胞中CENPF mRNA表達水平比較三組A549細胞中CENPF mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中CENPF抑制組A549細胞中CENPF mRNA表達水平低于對照組、陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 三組A549細胞增殖情況比較 三組A549細胞OD值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中CENPF抑制組A549細胞OD值低于對照組、陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.4 三組A549細胞凋亡率比較 三組A549細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中CENPF抑制組A549細胞凋亡率高于對照組、陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖2。

圖2 三組A549細胞凋亡情況的流式細胞儀檢測結果Figure 2 Flow cytometry test results of A549 cell apoptosis in the three groups

表1 三組A549細胞中CENPF mRNA表達水平和A549細胞增殖情況、凋亡率比較（x± s，n=6）Table 1 Comparison of CENPF mRNA expression levels in A549 cells，A549 cell proliferation and apoptosis rate in the three groups

2.5 三組A549細胞周期比較 三組G0/G1期、S期、G2/M期A549細胞所占比例比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中CENPF抑制組G0/G1期A549細胞所占比例高于對照組、陰性對照組，S期、G2/M期A549細胞所占比例低于對照組、陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖3。

表2 三組A549細胞周期比較（±s，n=6，%）Table 2 Comparison of A549 cell cycles in the three groups

表2 三組A549細胞周期比較（±s，n=6，%）Table 2 Comparison of A549 cell cycles in the three groups

注：與對照組比較，aP＜0.05；與陰性對照組比較，bP＜0.05

組別 G0/G1期 S期 G2/M期對照組 28.43±3.58 50.31±3.55 22.09±1.77陰性對照組 28.76±3.17 49.24±3.18 23.14±1.84 CENPF 抑制組 52.17±3.45ab 35.72±3.66ab 12.25±1.14ab F值 95.927 32.966 83.084 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖3 三組A549細胞周期的流式細胞儀檢測結果Figure 3 Flow cytometry test results of A549 cell cycles in the three groups

2.6 三組A549細胞中CENPF、cyclinD1、Bax表達水平比較 三組A549細胞中CENPF、cyclinD1、Bax表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中CENPF抑制組A549細胞中CENPF、cyclinD1表達水平低于對照組、陰性對照組，Bax表達水平高于對照組、陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖4。

圖4 Western blotting法三組A549細胞中CENPF、cyclinD1、Bax表達水平的SDS-PAGE圖Figure 4 SDS-PAGE image of CENPF，cyclinD1，Bax expression levels in A549 cells of the three groups detected by Western blotting

表3 三組A549細胞中CENPF、cyclinD1、Bax表達水平比較（x± s，n=6）Table 3 Comparison of CENPF，cyclinD1，Bax expression levels in A549 cells in the three groups

3 討論

NSCLC是肺癌的常見類型，占肺癌總數的85%，發病率、死亡率均較高，化療耐受能力、侵襲能力、遷移能力較其他類型肺癌強，通常采用以放化療為主的綜合治療方式，但易產生耐藥性，有效率低，毒副作用大，嚴重影響患者的生命健康［9］。近年來，靶向治療在癌癥治療中發揮著重要作用，因而明確與NSCLC發生發展及細胞生物學行為有關的關鍵分子，開發相關靶向藥物，對NSCLC的早期診斷和治療具有重要意義［10-11］。細胞的增殖、凋亡等生物學過程均與細胞周期密不可分［12］。CENPF與染色體排列、分離及紡錘體組裝有關，通過調控細胞分裂的重要原件——著絲粒影響細胞周期，在機體細胞分裂過程中發揮重要作用［6］。本研究分析CENPF在NSCLC組織中的表達水平及其對A549細胞增殖、凋亡等生物學行為的影響，以期為開發NSCLC靶向藥物提供理論參考。

近年來研究表明，CENPF在多種惡性腫瘤的發生、發展過程中均發揮重要作用［13-14］。本研究結果顯示，NSCLC組織中CENPF表達水平高于癌旁組織，提示CENPF可能參與NSCLC的發生發展。CENPF抑制組A549細胞中CENPF mRNA表達水平低于對照組、陰性對照組，提示本研究使用siRNA成功下調了CENPF在A549細胞中的表達。CENPF抑制組A549細胞OD值低于對照組、陰性對照組，CENPF抑制組A549細胞凋亡率高于對照組、陰性對照組，提示下調CENPF表達會降低A549細胞OD值，并提升其凋亡率，說明CENPF與A549細胞的增殖、凋亡過程有關。李瀟瑾等［5］研究亦表明，肝癌細胞和肝癌組織中CENPF表達水平均明顯升高，下調CENPF表達水平可降低肝癌細胞的增殖、遷移能力及存活率，并降低細胞增殖、細胞周期相關蛋白的表達水平。CHEN等［15］研究發現，CENPF在喉鱗狀細胞癌中表達水平升高并與腫瘤分化有關。SHAHID等［16］研究發現，CENPF的沉默可抑制癌細胞增殖、轉移，在前列腺癌細胞代謝紊亂中發揮作用。SUN等［17］研究表明，CENPF過表達與乳腺癌患者預后不良及腫瘤骨轉移有關。王建松等［18］研究發現，CENPF在肺腺癌組織及細胞系中高表達，與患者的惡性病理特征及不良預后密切相關，在肺腺癌發生、發展過程中起重要作用。CENPF可在細胞周期中發揮作用，本研究結果顯示，CENPF抑制組G0/G1期A549細胞所占比例高于對照組、陰性對照組，S期、G2/M期A549細胞所占比例低于對照組、陰性對照組，提示下調CENPF表達會提高G0/G1期A549細胞所占比例，并降低S期、G2/M期A549細胞所占比例，說明CENPF可能在細胞G0/G1期發揮作用，降低其表達后，可將A549細胞阻滯于G0/G1期，導致細胞增殖過程受阻，并導致細胞凋亡。

Bax是凋亡調節基因Bcl-2家族的重要成員，可發揮促進細胞凋亡的作用，在癌癥中表達水平降低，上調其表達水平可誘導癌細胞凋亡［19］。cyclinD1是細胞周期中G1期向S期進展的重要調控因子，在癌癥中表達水平升高，與癌細胞強大的增殖能力有關，下調其表達水平可抑制癌細胞的增殖過程［20］。本研究結果顯示，CENPF抑制組A549細胞中CENPF、cyclinD1表達水平低于對照組、陰性對照組，Bax表達水平高于對照組、陰性對照組，提示下調CENPF表達會降低A549細胞中cyclinD1表達水平，提高Bax表達水平，說明CENPF可通過影響cyclinD1、Bax表達水平來影響細胞周期進展及A549細胞的增殖、凋亡過程。

綜上所述，CENPF在NSCLC組織中表達升高，其可通過影響cyclinD1、Bax表達水平來影響A549細胞周期進展及增殖、凋亡過程；下調其表達可將A549細胞周期阻滯于G0/G1期，抑制細胞增殖并誘導其凋亡，這有可能成為NSCLC治療的新靶點。然而體外培養并不能完全模擬體內環境，下一步還需在動物模型中加以驗證本研究結論。

作者貢獻：常彥祥進行文章的構思、設計與可行性分析，文獻收集，論文撰寫；孫利平進行數據收集、整理、分析；李斌負責論文修訂及文章的質量控制、審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。