張濤 陶超 劉曉峻
(南京大學聲學研究所 近代聲學教育部重點實驗室 南京 210093)
生物活體組織的定征和分類不僅對于生命科學基礎研究具有重要科學價值,而且對于藥學、臨床醫學等領域也有著重要應用前景。因此,組織定征和分類得到生物醫學成像領域的持續關注[1?3]。
利用光學成像方法是最常用的生物醫學成像技術,并被廣泛地應用于組織病理切片檢查等領域。基于每種原子和分子均具有獨特的光譜特性,光學成像可以特異性地檢測生物組織生化成分,從而靈敏地反映生物組織的功能信息。因此,光學成像具有對比度高、區分度好、功能信息豐富的優點。為此,人們研發出多種光學成像系統,包括共聚焦激光掃描顯微鏡[4]、雙光子顯微鏡[5]、光學相干斷層成像[6]等,這些光學成像技術在生物醫學上取得諸多的成功應用。但是,由于生物組織是光的強散射媒質,光波在組織中傳播的平均自由程僅1 mm[7]。當超過這個深度后,強烈的隨機散射會干擾光束的有效聚焦。所以,在強散射組織中,光學方法成像深度受限,通常只能獲得深度1 mm以內高質量組織圖像,當成像深度大于1 mm時,其空間分辨率嚴重下降,大約僅有成像深度的1/3[8]。
聲學成像由于其生物安全性高、成像深度深、經濟易用等特點,而成為臨床醫學應用最廣泛的成像技術之一。聲學成像以聲波為信息載體,聲波是機械波,相較于光波,其波長更長。因此生物組織對聲波的散射強度遠弱于其對光波的散射強度,組織中的聲散射比光散射要弱2~3個數量級。這使得在深層組織中,聲學成像的空間分辨率可以達到成像深度的1/200,遠遠優于光學成像[7]。傳統聲學成像的成像參數來自組織的力學參數,比如B超利用組織聲阻抗差異用超聲回波進行圖像重構。但是,軟組織中各種成分的聲阻抗差異并不顯著,所以聲學成像的對比度不高,分辨組織的功能特性不如光學成像那樣敏感。
光聲成像是基于光聲效應的一種新型復合無創生物醫學成像技術[7]。當生物組織被脈沖或者調制激光照射后,組織中的光吸收體吸收激光能量而產生瞬時熱膨脹,進而向周圍媒質輻射超聲波,這就是光聲效應[9?10]。光聲效應激發出來的超聲波信號又叫光聲信號。通過接收組織激發出來的光聲信號,可以反演組織中的光吸收系數空間分布,并構建圖像。可以這樣說,光聲成像過程以超聲波為載體,獲取組織深處的光學吸收信息。因此,光聲成像兼具了聲學成像在深層組織中成像深度深、空間分辨率高的優點,又具有光學成像對比度高、功能信息豐富的優點[7,11]。而且,由于光聲成像是非電離輻射的成像技術,故相較于X射線成像和CT成像等這種電離輻射成像手段,光聲成像生物組織安全性好。因為這些優點,光聲成像得到了極大的發展并且已經融入了各種生物醫學應用中,比如腫瘤檢測[12?13]、微血管成像[14]、骨關節炎評估[15]、毒品安檢[16]等。
本文簡要地解釋了光聲成像的基本原理,以及光聲顯微鏡成像(Photoacoustic microscopy,PAM)和光聲計算機斷層成像(Photoacoustic computed tomography,PACT)這兩種典型的光聲成像實現方案,最后綜述了從光聲信號中提取組織微結構特征參數的研究,并討論它們在組織分類中的潛在應用。
光聲成像系統利用脈沖激光或調制激光照射生物組織,組織中的光吸收體吸收激光能量導致溫度升高,如果脈沖激光寬度小于熱激發弛豫時間,光吸收體在極短的時間內吸收大量激光能量而產生局部壓力,然后激光照射消失,熱脹冷縮使得這種局部壓力釋放,并向周圍媒質輻射超聲波,這就是所謂的光聲效應,光聲效應產生的超聲波又被稱為光聲波或光聲信號。對于任一時刻t、空間任一位置r處,光聲波的壓強p(r,t)的時空分布由公式(1)描述[17]:

其中,聲源分布p0(r0)=Γ(r0)A(r0),c是組織中的聲速,τ(t)是激光脈沖的脈寬,Γ(r)和A(r)是成像區域的Grüneisen系數和光吸收系數的空間分布函數。組織內部激發出來的光聲信號經傳播后,會被布置在組織周圍的超聲換能器或者超聲換能器陣列接收到,根據接收到的光聲信號p(r,t),求解光聲傳播的逆問題,從而反演光聲聲源的空間分布p0(r0)[18?21],并且據此獲得光聲圖像。因為聲源分布p0(r0)與成像區域的光吸收系數空間分布A(r0)成正比,所以光聲圖像的對比度與組織中的光吸收系數分布相關。正因為如此,光聲成像與光學成像一樣,具有豐富的光學對比度,能夠無標記地獲取組織的生化和功能信息。另一方面,光聲成像過程中,光吸收信息是以超聲波為載體傳播并被檢測到的,由于超聲波在生物組織中低散射、低衰減、高穿透的特性,光聲成像又像超聲成像一樣能夠獲得組織深處高分辨率的圖像。
根據光聲信號的激發、接收方式的不同,光聲成像技術可以大致分成光聲顯微鏡成像和光聲計算機斷層成像兩類實現方案。根據需求的不同,它們可用于達到不同的空間分辨率和成像深度。
光聲顯微鏡通常將脈沖激光聚焦在成像樣品上激發光聲信號,并利用點聚焦超聲換能器接收光聲信號,為了獲得最優的探測靈敏度和成像分辨率,通常需要使得聲焦點與光焦點共聚焦[22?24],見圖1(a)。根據每一點接收到的光聲信號強弱可以反演該點光吸收系數大小;根據接收到的光聲信號延時,可以計算光吸收體在超聲換能器聲軸上的位置,從而獲得該點的一維圖像。進一步通過逐點掃描樣本,不需要復雜的成像算法,就可以得到樣品二維或三維的光聲圖像。

圖1 光聲顯微鏡成像系統示意圖Fig.1 Schematic diagram of photoacoustic imaging systems
當成像深度小于生物組織的光學平均自由程時(約1 mm),由于激光能夠在此深度范圍內有效聚焦,光焦點大小可以達到光學衍射極限,光學聚焦性能優于聲學聚焦性能,光學焦點小于聲學焦點,此時光聲顯微鏡系統的側向分辨率(也就是垂直于聲軸和光軸的面)主要取決于光學焦點的大小,可以達到0.51λopt/NA,NA是光學透鏡的數值孔徑,λopt是激光的波長。因為分辨率是激光焦點決定的,這種光聲顯微鏡系統又被稱為光學分辨率光聲顯微鏡(Optic-resolution PAM,OR-PAM)。而圍繞光學焦點與聲學焦點共聚焦的問題,很多新穎的解決方案被提了出來,例如換能器與光源相對放置在樣品兩側的檢測方式[25?27];亦或使用允許激光從中間通過的環形換能器進行檢測[28];采用夾膠透明棱鏡折射聲路的探測方案[23,29];此外,通過增加聲反射板的反射式光學分辨率光聲顯微鏡系統,見圖1(b),可以在不要求定制改動光學、聲學硬件的情況下,大幅提高聲學探測靈敏度,進而提高成像質量[30]。雖然光學分辨率光聲顯微鏡的成像深度僅有1 mm左右,但是它最高可以提供納米級的側向分辨率[31]。
當成像深度大于1 mm、光焦點深度超過生物組織的光學平均自由程時,由于組織對激光強烈散射作用,光學聚焦質量變差,聲學聚焦開始優于光學聚焦,聲焦點大小小于光焦點大小。這種情況下,光聲顯微鏡的側向分辨率取決于聲焦點尺寸0.71·vs/(f0·NA),其中vs、f0、NA分別為組織中聲速、光聲信號中心頻率、聲學數值孔徑[7]。由于這種類型的光聲顯微鏡其側向分辨率取決于聲焦點大小,因此它又被稱為聲學分辨率光聲顯微鏡(Acoustic-resolution PAM,AR-PAM)[24]。聲學分辨率光聲顯微鏡的成像深度可達幾毫米至幾十毫米,成像分辨率可達幾十微米到一兩百微米。此外,通過綜合運用超聲-光聲多模成像技術、合成孔徑成像與虛擬點探測器等一系列新技術[32?33],可以進一步提高聲學分辨率光聲顯微鏡的成像質量。如圖1(c)所示,采用自校準聲速虛擬點探測器的方法,可以顯著提高聲學分辨率光聲顯微鏡非聚焦區域的圖像質量。
光聲顯微鏡需要通過逐點掃描樣品,獲得光聲圖像,這一過程限制了光聲顯微鏡在較大成像區域的成像時間,而光聲計算機斷層成像則可以提供更深的成像深度、更大的成像區域、更快的成像速度。
光聲計算機斷層成像采用非聚焦光源照射整個成像區域,然后利用包圍成像區域放置的非聚焦或線聚焦超聲換能器陣列接收來自樣品的光聲信號(見圖2),并通過求解光聲傳播的逆問題重構光聲圖像。光聲計算機斷層成像的圖像構建依賴計算機計算和圖像重構算法,常見的重構算法有反相投影算法[21,34]、延時求和法[35],目前廣泛采用的通用反相投影重構公式由Xu等[21]提出:

其中,p0(r)為位置r處的初始聲壓,Ω0是測量面S0關于重構點的立體角,ns0是測量面關于源點的單位法向量。
此外,為了克服組織非均勻聲學特性對成像效果的不良影響,人們還提出了利用虛擬聲源實現格林函數重構[18],將隨機矩陣理論的濾波算法與時間反轉法相結合[19],以及全矩陣相干濾波器[20]等多種成像算法,提升光聲計算機斷層成像的成像效果。
光聲計算機斷層成像的成像深度可達6~7 cm,其成像軸向分辨率取決于超聲換能器的帶寬?f,為0.88·vs/?f[7],vs是組織中的聲速。因此,光聲計算機斷層成像的空間分辨率和穿透深度可以通過選擇具有合適頻率和帶寬的超聲換能器進行調節。
總而言之,光學分辨率的光聲顯微鏡、聲學分辨率的光聲顯微鏡、光聲計算機斷層成像在成像深度和成像分辨率上提供了多尺度的生物醫學成像技術。

圖2 光聲計算機斷層成像系統示意圖[36]Fig.2 Schematic diagram of photoacoustic computed tomography[36]
基于分子特定的選擇性光吸收特性,光聲成像能夠靈敏地揭示組織的分子構成的差異。利用不同波長或者復合波長的脈沖激光激發光聲信號,光聲成像成功無標記地獲取了細胞核、脂肪和蛋白質、血氧飽和度、血紅蛋白濃度、血管的高對比度圖像[13,28,30?32,37?39](見圖3)。

圖3 生物組織中的光聲成像Fig.3 Photoacoustic imaging in vivo
然而,除了生化組分和分子信息外,生物組織的微結構特性,例如微結構尺寸、微結構數量密度、微結構彈性等,也是區分不同組織類型的有效標識。并且,組織的生理功能與其微結構特性密切相關,因此對組織微結構信息的評估有著極高的生物醫學應用價值。光學分辨率的光聲顯微鏡雖然具有足夠高分辨率揭示組織的微觀形態,但是它的成像深度僅有1 mm,并不適合對深層組織微結構特性進行原位檢查。聲學分辨率的光聲顯微鏡和光聲計算機斷層成像能夠獲得深層組織的圖像,并且具有聲學分辨率精度。它們的分辨率主要取決于接收到的光聲信號的頻率及帶寬,因此,必須采集高頻、寬帶的光聲信號,以獲得足夠的分辨率來呈現組織的精細結構。但由于超聲波在生物組織中傳播衰減隨著頻率的升高而增加,高頻超聲波在組織中的強衰減會嚴重制約這兩種成像技術的成像深度。例如,為了獲得45μm的成像分辨率,接收的光聲信號中心頻率需要高達50 MHz,在如此高的頻率下,聲波僅能在組織中傳播約3 mm[40]。總而言之,評估深層組織的微觀結構信息依然是一項具有挑戰性的課題。
近期,一系列研究揭示光聲的原始射頻信號含有與生物組織微觀特性相關的豐富復合信息,通過對光聲射頻信號的分析,從而提取與生物組織的微結構相關的特性參量,為組織分類提供的新的視野和技術可能性。
組織的微觀結構的特征尺寸是組織的一項基本屬性,它指的是構成組織微小單元的大小,例如細胞團或色素團的大小、微血管的直徑等[41?42]。因為實際組織的微結構的空間分布具有隨機性,其光聲信號總是呈現出類似噪聲信號的隨機性。所以,對信號隨機波形的分析難以揭示組織的微觀結構特征尺度。然而,通過對光聲信號功率譜的研究,可以有效地提取與組織微觀結構尺度相關的特征參量。光聲信號功率譜分析是提取組織微結構特性的一個有效的工具[43?44]。人們利用蒙特卡洛模擬和實驗測量,發現光聲信號的功率譜性質和紅細胞聚集水平相關[42],還和單個紅細胞的形態學相關[45]。另外,在離體實驗中,人們也發現癌變組織與正常組織的光聲功率譜有著顯著的差異[46]。
Yang等[47]理論解析了微結構尺寸和歸一化光聲功率譜之間的關系:

公式(3)成功預測了隨機微觀結構光聲信號功率譜的幾個基本性質:(1)隨機組織的光聲信號有確定性的功率譜特性,微結構特征尺寸越大,其產生的光聲信號功率譜帶寬更窄,反之則功率譜帶寬更寬。(2)歸一化光聲信號功率譜的斜率與系統增益、光源強度等測量設備參數無關,而僅與組織微結構特性有關,因此,光聲頻譜參數可以提供排除系統響應影響的定量結果[41]。(3)光聲功率譜的差異可以通過對功率譜進行最佳線性擬合得到頻譜斜率參數進行量化。微結構尺寸越大,功率譜斜率越小。所以光聲功率譜斜率可以量化組織微結構的特征尺寸。一個更有趣的發現是,上述性質在光聲信號的低頻段依然是成立的,因此,光聲功率譜斜率作為成像參數,可以區分聲學亞波長尺寸的微結構,從而有望利用低頻窄帶光聲信號對深層組織的隨機微觀結構進行定量分析。理論分析的結論很快就被含有微球仿體實驗驗證了[47?50]。基于此,采用光聲功率譜斜率便能有效地根據不同的微結構尺寸,對深層組織進行分類[51]。如圖4(c)所示,對健康牙齒牙冠以光聲信號的頻譜斜率為對比度參數成像時,可以看到牙齒有清晰的兩層結構,其中牙本質對應頻譜低斜率區域,牙釉質對應頻譜高斜率區域,實現了對牙本質與牙釉質的有效區分。接著,這個理論還被成功地拓展到由非均勻尺寸的微結構中或者微血管網絡中[42,52]。聲學分辨率光聲顯微鏡同樣能對深層組織進行分類,其成像對比度源自組織的光吸收特性,而其側向分辨率則取決于聲焦點的大小。當微結構尺寸小于聲焦點時,就需要提高成像系統的中心頻率,而高頻聲波在組織中的強散射特性,又反過來制約了成像深度。也就是說,對于聲學亞波長光吸收體,聲學分辨率光聲顯微鏡無法對微結構尺寸進行區分。而基于頻譜參數,可以定量地表征微結構的尺寸,并以微結構尺寸為對比度參數進行成像,進而實現對深層組織中聲學亞波長尺寸微結構的區分[42]。如圖5所示,對于中心頻率為4.39 MHz的傳統光聲顯微鏡,無法區分厘米量級深度下60μm以及150μm尺度的微血管網絡,而以功率譜斜率為成像參數的成像結果則可以進行區分。

圖4 對一顆健康牙齒牙冠的光聲成像結果[51]Fig.4 Photoacoustic imaging of the crown of a healthy tooth[51]

圖5 對聲學亞波長尺寸微血管仿體成像結果[42]Fig.5 Photoacoustic imaging of acoustic sub-wavelength sized microvascular phantom[42]
光聲信號的功率譜性質為解決一系列常規成像手段面臨的實際難題提供了新的解決方案,這些問題有設備依賴性、微結構尺寸的量化和隨機微結構的可重復性實驗,以及聲學亞波長尺寸結構的定量評估與分類。這些優點說明了,功率譜參數可以克服成像分辨率和成像深度之間的沖突,并且為探測深層組織的隨機微結構尺寸提供了有價值的工具。所以,光聲信號的功率譜分析被發現有一系列的潛在應用,包括血管網絡增生、早期牙體病變檢測、肝臟組織分化、腫瘤檢測、骨骼檢查等[42,46,51,53?55]。
組織微結構數量密度是組織的另一個重要屬性。微結構數量密度是指單位體積內特定的微小單元的數量,例如微血栓、細胞團、血管數量密度等[26,56]。研究表明統計學方法也是評估組織微結構特性的一種有效手段。超聲檢測技術的研究表明超聲回波信號的統計參數可以反映肝臟纖維化程度[57]、骨質疏松程度[58]、區分良性或惡性腫瘤[59]、評估乳房腫塊等[60]。光聲檢測的研究也表明,光聲信號的包絡統計性質在檢測組織微結構方面也極具價值。隨機分布的紅細胞光聲信號包絡統計直方圖可以很好地用瑞利分布擬合[41]。根據統計參數或者包絡統計直方圖的變化可以區分不同組織[61]或者檢測出混合有黑色素瘤細胞的紅細胞[62]。最近,Nakagami統計被用來分析光聲信號包絡R(t)的統計特性,并對隨機微結構的數量密度進行定量化研究[63]。Nakagami分布的概率密度函數為[64]

其中,信號包絡R可以用希爾伯特變換計算,Γ和U是Gamma函數和單位階躍函數。參數m、Ω分別代表Nakagami形狀參數和尺度因子,決定了概率密度函數f(R)的形狀和范圍。尺度因子Ω不僅與微結構的內在特征有關,還與測量系統特性有關,例如激光強度和系統增益等。然而,形狀參數m僅與微結構的分布形狀有關。參數m和Ω可以用最小二乘法擬合來確定,或者可以用m=[E(R2)]2/E[R2?E(R2)]2和Ω=E(R2)來確定,E代表數學期望值。理論計算仿真與實驗測量表明,Nakagami形狀參數m是一個與測量系統無關的統計參量,它會隨著微結構數量密度的增加而單調地增加,因此可定量地衡量微結構的數量密度[63]。結合了Nakagami形狀參數和功率譜斜率參數的光聲計算機斷層成像系統,成功地區分了具有不同微結構特性的實驗仿體[63]。如圖6(a)所示,依據仿體微結構尺寸和數量密度的差異,樣品分為S1、S2、S3三個等大小的子區域。圖6(d)顯示以光聲信號功率譜斜率為參數成像成功地區分了不同尺寸的微結構,而圖6(e)顯示以Nakagami形狀參數m為參數成像成功地區分了不同濃度的微結構。

圖6 混合仿體的多成像參數光聲計算機斷層成像結果[63]Fig.6 Photoacoustic computed tomography imaging of the mixture phantom with different imaging parameters[63]
組織中微結構的彈性是一個組織特性的重要標記參數,它可以用來區分不同組織,識別多種涉及組織病變的疾病,例如肝硬化[65]、動脈粥樣硬化[66]和前列腺癌[67]等。已有很多技術方法用來評估材料的彈性特性[68?71],然而它們各有其優缺點。超聲彈性成像是一種無侵入式的并且被廣泛用于臨床檢測組織彈性的手段,但是受限于超聲的波長,這種手段僅適用于較大尺度組織。超聲共振法是另一個常用的彈性檢測的技術,但它往往要利用接觸式換能器激發待測物的機械共振,并利用接觸式換能器或光學技術檢測物體的振動信息,其中的光學技術雖然是非接觸式的,比如激光多普勒干涉儀,但如果待測目標浸在渾濁的媒介中(生物組織普遍符合這一情況),光的強散射就會限制它的應用。此外,這種辦法需要把樣品切割成特定的形狀,所以超聲共振法并不適合用于非均勻的生物活體組織。原子力顯微鏡可以提供高精度的局部彈性檢測,但是,它僅局限于表面或者亞表面的檢測。
最近,通過測量彈性光吸收物體產生的光聲信號,人們發現了光聲本征振動現象[72]。當彈性光吸收體被脈沖激光照射時,彈性體會吸收光能并由于熱彈效應釋放出超聲波。當激光照射撤去后,彈性體由于慣性和彈性會持續振動一段時間并持續向周圍組織發出超聲波,如圖7(a)所示。由于彈性體在此階段處于自由振動狀態,其振動模式和彈性體的本征振動模式相關,而輻射的超聲波的頻譜則和彈性體的本征振動頻率有關,也就是說光聲信號里包含了彈性體的本征振動信息。由于本征振動模式和本征頻率取決于彈性參數,所以通過分析光聲信號的頻譜特性,還可以反演微結構的彈性特性。通過利用這個辦法對各種材料的彈性參數的成功測量,證明了光聲本征譜理論的正確性和應用潛力[72?74]。

圖7 對鈣鈦礦晶體MAPbBr3的光聲本征譜分析[74]Fig.7 Photoacoustic spectrum analysis of perovskite MAPbBr3[74]
相比于其他彈性檢測方法,光聲本征譜法有其獨特的優勢。首先,它可以一次測得樣品的所有彈性參數,無需對樣品進行特定方向的切割;第二,這個方法完全是非接觸式的,無論是振動的激發還是信號的檢測,都無需接觸被測樣品;第三,不同于激光超聲法[75],這種方法檢測的是從振動樣品向外輻射的超聲信號,而不是直接檢測振動樣品表面的位移。這些特點使得這種方法適用于稀有的、易碎的和小型的樣品,尤其是當樣品浸在渾濁的以及不透明的液體媒質中的情形,這給檢測生物組織不同區域的彈性差異提供了新的可能。
傳統的光聲成像技術的對比度來源于組織的光吸收特性,但光聲信號的激發、傳播過程涉及光學、熱學、力學等多種物理效應,因此光聲成像具有檢測組織多種參數的優勢。本文詳細討論了通過檢測組織微結構的尺寸、數量密度、彈性,利用多種光聲成像技術實現對組織微結構特征的非侵入性檢測。其中,微結構的數量密度參數,是從光聲信號時域上的包絡統計分析獲得的;而微結構的尺寸與彈性則是通過對光聲信號功率譜的分析得到,其差異在于彈性參數與樣品的本征振動信息相關,故在功率譜分析時只對尾波進行處理。同時,彈性是微結構的宏觀屬性,與微結構的尺寸、數量密度息息相關,例如,乳腺腫瘤區域的血管數量密度異常增大,其彈性較大[13]。可以得到啟發,通過對組織進行多維度參數的表征,可以大大豐富組織分類信息,進而提高組織分類的準確度。
近二十年來,由于光聲成像技術的諸多優點和其巨大的生物醫學應用潛力,關于光聲技術的研究一直得到各國研究團隊的高度重視。本文介紹了光聲成像的物理基礎,以及光聲顯微鏡和光聲計算機斷層成像這兩種主要的光聲成像實現方案,并且討論了它們在成像深度和成像分辨率上性能的差異。最后介紹了根據光聲信號對組織微結構特征評估的研究。
光聲信號的光聲功率譜斜率反映了組織的微結構特征尺寸;光聲信號包絡的統計特性包含有微結構的數量密度信息;分析光聲信號的光聲本征譜可以獲得微結構的彈性特性。這些新方法突破了傳統的光聲成像系統頻率和帶寬的限制,為研究深層組織的各項微結構性質提供了可能的手段。然而,在實際生物醫學應用之前,仍有許多工作需要完成,從而進一步改善這些方法。例如,更多的活體和離體實驗來檢查真實組織的光聲功率譜參數和統計參數,尤其是混合各種微結構的復合組織。這些參數和各種生理狀況的關系應該還需被進一步探索。另外,光聲本征頻譜的應用也有一些制約,比如,彈性的量化評估依賴于一些微彈性體的先驗知識,包括形狀、密度等,而且對于提取高黏度組織的光聲本征譜也是一個重要的技術挑戰。
近年來對光聲成像技術的積極研究已經闡明了其在生物醫學領域有很多的潛在應用價值,可以期待,從光聲信號中還可以提取更多的關于組織特性的有價值的信息。受益于光聲信號中蘊含著的豐富的生物結構和功能信息,光聲成像技術作為一個非電離的、非侵入式的技術,將會提供多模態組織信息,從而有望被廣泛地應用于基礎研究和臨床診斷。