超聲聯合微泡增強細胞內藥物遞送的研究進展?

范真真 張蘇妍 張美如 王裕琳

(天津大學精密儀器與光電子工程學院 天津 300072)

0 引言

細胞是最小的生命單元。將功能性的生物分子或者材料遞送到目標細胞內，是解碼細胞功能、改變細胞命運以及重新編碼細胞行為的重要一步。正是由于細胞內遞送在基礎科學研究和臨床治療上的重要價值，為了實現這一過程，眾多的物理、化學和生物方法被開發出來。Stewart等[1]近期的綜述對所有以干擾細胞膜為基礎的細胞藥物遞送技術進行了完整的論述。超聲和微泡聯合使用，通過微泡的聲空化與細胞膜的相互作用，實現靶向的細胞內藥物遞送。超聲是一種體外施加的、具有良好的組織穿透深度、時空高度可控的物理能量。而作為超聲造影劑的微泡已經在臨床上得到廣泛應用，因此超聲聯合微泡的細胞內藥物遞送技術在臨床應用方面具有獨特的優勢。

1997年，Miller教授的研究組首次報道了超聲和超聲造影劑微泡聯合使用顯著增加了質粒DNA對細胞的轉染效率[2]，從而開啟了超聲聯合微泡增強藥物靶向遞送的研究方向。在Web of Science以“ultrasound”、“microbubble”和“delivery”為關鍵詞，搜索到的文章數目隨年份的關系如圖1所示。在20余年的發展進程中，現象發現和機理闡釋貫穿始終。從研究對象來說，從體外細胞試驗逐漸進入動物實驗，并于2013年首次進入了臨床試驗；從技術發展的角度來說，不斷豐富微泡的功能性以及提高超聲對微泡聲學響應的可控性是近年來的研究重點。本文圍繞超聲聯合微泡實現藥物遞送的發生機理，綜述了近年來的研究進展，并就未來的發展提出了作者的幾點建議和思考。

圖1 Web of Science以“ultrasound”、“microbubble”和“delivery”為主題的文章數目與年份關系Fig.1 The number of papers on“ultrasound”,“microbubble”and“delivery”versus years in Web of Science

1 微泡的聲學動態響應

微泡在細胞旁發生的聲空化是增強細胞內藥物遞送的物理基礎。超快速照相機的直接觀測，清晰地展示了單個微泡在穩態空化時發生的微泡壁的周期性振動，及其對細胞膜周期性地擠壓[3](圖2(a))；在瞬態空化時微泡壁劇烈振動甚至破碎、崩塌[4](圖2(b))或形成高速微流體噴流[5](圖2(c))，這些劇烈的沖擊會使細胞膜局部下凹、形成小孔甚至死亡。微泡空化時在周圍空間會形成微流體流(圖2(d))，從而對附近的細胞膜施加剪切力[6?7]。當有多個微泡比鄰時，在次級聲輻射力的驅動下，微泡會聚集，甚至融合為更大的微泡(圖2(e))，可能進一步降低周圍細胞的存活率[8?9]。

圖2 微泡的幾種不同的聲學動態響應Fig.2 Several different acoustic dynamic responses of microbubbles

在穩態空化時，自由的氣體小泡的半徑隨時間的振動可以用Rayleigh-Plesset公式進行描述[10]；加入了微泡膜結構的流變性的物理模型，更為準確地描述了具有膜結構的現代微泡在聲場中的振動[11]。Forbes等[12]提出了理論模型及實驗觀測，表明了微泡空化形成的微流對細胞膜的剪切力可以導致聲孔效應。Guo等[13]通過使用邊界單元法，把微泡和細胞視為液體中的球體，對微泡與細胞的相互作用過程進行了系統的理論研究。Yang等[14]近期的綜述圍繞微泡與微泡的相互作用，系統討論了微泡、細胞的物理參數，超聲參數、細胞微環境等對藥物遞送效果的影響。微泡在細胞或者黏彈性各異的生物物質旁發生空化現象，從而實現增強細胞內藥物遞送的目的。Dollet等[15]近期的綜述從理論到實驗觀測回顧了生物物質的存在對微泡聲學動態響應的影響。

對微泡膜的修飾，進一步增強了微泡的功能性，可以實現微泡對目標細胞的靶向附著，或者成為藥物的載體，實現藥物的靶向釋放。Kooiman等[16]使用超高分辨顯微成像觀測了不同化學成分的膜所包裹的微泡，與基質相連所形成的不同的附著面積和形變。Rong等[17]使用了獨特的成像策略，觀察到了靶向微泡與細胞相連后，所呈現出的6種不同的形態，如圖3(a)所示。圖3(a)中第一行代表靶向微泡與細胞相連的形態的示意圖，第二行代表兩通道疊加的熒光圖像，第三行代表每種形態對應的邊界檢測結果。在大多數情況下，靶向微泡會有一小部分黏附在細胞膜上，這使得微泡在超聲激勵下不能進行各向同性的球面振動。Lajoinie等[18]提出了非球面、軸對稱的數學模型，描述了靶向微泡在聲場中的體積振動，如圖3(b)所示。圖3(b)中的上圖為相同微泡大小(R0=2.4μm)和不同壓力(kPa)(顏色)下，塌縮階段的尖端的形狀(左圖)，z表示在微泡形狀的不同位置高度，r表示微泡對應位置z的橫切面半徑。磷脂表面積S的是仰角θ的函數(右圖)；下圖為具有不同初始半徑R0的靶向微泡在210 kPa壓強驅動下的模擬形狀。該模型被用于預測加載在微泡膜上的藥物分子隨微泡振動而釋放的過程。Baresch等[19]實現了單束渦旋聲場在復雜環境中對微泡的捕獲和操控，以及微泡振動而導致的可控的載藥釋放。

圖3 靶向微泡形態及振動模擬Fig.3 Morphology and oscillation simulation of targeted microbubbles

2 細胞響應

2.1 細胞膜上出現瞬態、可逆的小孔

當較為劇烈的聲空化發生在細胞附近時，會在細胞膜上打開小孔。小孔的形成首先是在超聲作用后迅速固定的細胞上得到證實。Prentice等[5]使用原子力顯微鏡，觀察到了細胞上直徑為16μm的小孔(圖4(a))。Schlicher等[20]以及Qiu等[21]使用掃描電鏡和透射電鏡，觀察到了細胞膜上直徑在1μm左右的小孔(圖4(b))。隨后，一些實時技術被引入到了聲孔的觀測中。Zhou等[22]和Fan等[23]使用全細胞膜片鉗，監測整個細胞的過膜電流的實時變化。當有小孔打開時，過膜電流會突然增大，而后隨著小孔的閉合而逐漸減小直至恢復為零；并通過對過膜電流的擬合，估算出可逆小孔的直徑在10～200 nm(圖4(c))。Hu等[24]使用共聚焦熒光顯微成像，對熒光染色的細胞膜進行了實時直接觀測；觀察到了直徑為5.3μm的可逆小孔(圖4(d))。

Prentice等[5]使用原子力顯微鏡觀察到了深為1μm的小孔，以及一些穿透細胞直達基質的孔。Helfield等[7]使用實施共聚焦熒光顯微鏡觀察到了空化所致的小孔穿透了細胞的上下表層。Rong等[25]在超聲作用后迅速固定的細胞中觀察到了細胞核內、細胞底部都出現了質粒DNA。這些結果表明，小孔的深度可以穿透整個細胞。

在聲空化作用下，質膜上孔是否發生以及發生位置會受到微泡大小和微泡與細胞之間距離的影響[26?27]。不同的細胞之間距離與微泡直徑的相對大小對應于不同的膜穿孔效率[26,28?30]。因此，改變膜穿孔效率可以通過調整微泡與細胞之間的距離(d)與微泡大小(D)的比值(d/D)來實現[26,28?30]。除了改變超聲發生模式外，也可以采用利用配體或抗體修飾微泡的方式，即將被修飾的微泡與細胞表面受體相結合進而改善輸送效率。該方式作為應用于靶向藥物輸送的新的途徑，具有相當大的臨床治療價值。

小分子物質碘化丙啶是不可滲透細胞膜的，在細胞外不顯熒光；當它進入細胞與核酸結合后，會顯示出紅色熒光。碘化丙啶的這種熒光特性使其成為實時指示細胞膜上的小孔的理想指示劑，在聲孔效應的機理性研究中廣泛使用。碘化丙啶的實時熒光顯微成像顯示，在空化現象發生后，細胞膜上的小孔隨即迅速打開，之后逐漸收縮至閉合；成功閉合的過程一般在100 s之內[7?8,17,23,30?31]。全細胞膜片鉗記錄過膜電流，比熒光成像具有更高的時間分辨率(0.5 ms)，但是由于超聲振動極易振掉膜片鉗與細胞膜形成的緊密吸附，限制了膜片鉗的記錄能力。Zhou等[22]和Fan等[23]使用全細胞膜片鉗記錄到的小孔成功閉合發生在10 s之內。Hu等[24]對熒光染色的細胞膜進行了實時直接觀測，結果顯示小孔成功閉合的過程在50 s之內。總之，小孔的直徑、位置、深度和閉合時間由多種因素共同決定，包括超聲參數[32]、微泡特性[8]、微泡和細胞的距離[29,33]等。這些小孔的存在增加了血管通透性，有助于膜上藥物的轉移。

關于小孔閉合的機制，多項研究表明[34?36]，鈣離子經小孔流入細胞內是小孔成功閉合的必要條件。Leow等[35]觀察到在靶向微泡附著的位置，在超聲作用后，僅在存活的細胞的細胞膜上出現起泡的現象，因此推測細胞膜的起泡是幫助細胞恢復平衡狀態的方式。聲孔尺寸很小，且在存活的細胞中是瞬態存在，這給研究小孔閉合的生物學機制提出了不小的挑戰。作為一種機械損傷，聲孔很可能也是經歷擴張、收縮和閉合3個階段；細胞經歷感知小孔、修復小孔、閉合小孔和重塑細胞膜及細胞骨架的過程；修復過程可能由鈣肌動蛋白和肌球蛋白驅動，由細胞膜的流動性、內吞、胞吐作用參與完成[37]。小孔的閉合能夠實現是保證細胞維持活性的必要條件，對于臨床應用來說也是保證超聲聯合微泡技術應用的安全性和實用性的必然要求。

圖4 細胞膜上小孔的形態和實時監測Fig.4 Morphology and real-time monitoring of the pores on the cell membrane

2.2 其他細胞層響應

當有小孔打開時，實時熒光顯微成像可觀察到同時發生的自小孔流入的鈣離子流。由于細胞內外存在的巨大的自由鈣離子濃度的差異(細胞培養液的鈣離子濃度為0.9 mM，細胞內的鈣離子濃度在100 nM以下)，在濃度梯度的驅使下，鈣離子迅速的從小孔進入細胞，在5～10 s內達到濃度峰值，之后逐漸恢復到平衡態(大約100 s左右)[23,38]。隨后，與發生聲孔效應相鄰的一些細胞會出現延遲的、峰值更小的鈣離子濃度的波動(即細胞間的鈣波)[23,38]。鈣離子是重要的第二信使，參與諸多細胞功能的調控，因此聲孔效應所引發的鈣波有可能參與較為長期、更大范圍的生物效應的調控。

細胞骨架與細胞膜相連，是貫穿整個細胞的重要細胞結構。細胞骨架為細胞提供機械強度和力學支撐，在維持細胞形態、實現細胞形變和遷移和細胞內物質運輸等方面發揮著重要作用。Chen等[39]、Fan等[31]以及Wang等[33]都觀察到聲孔效應迅速引發細胞骨架的分解，從聲孔處發展到整個細胞，即使細胞存活下來，細胞骨架在很長時間內(60 min)未能恢復。

當細胞受到空化作用刺激時，內吞作用被觸發。一方面，如前文所述，內吞作用促進了膜的重新閉合，另一方面空化刺激的內吞作用也被認為是一種主動傳遞途徑，大分子物質可以被吸收進入細胞。但由于內吞作用的觸發主要與聲空化作用刺激相關的生物或/和物理信號有關，從而引起細胞本身活躍的行為，因此很難得到內吞作用與微泡作用域之間的空間關系。

內皮細胞間往往通過多種蛋白質大分子相互連接，而其中部分種類的蛋白質又往往與細胞內的細胞骨架相連。空化作用可能會引起膜穿孔，進而引起細胞骨架、內皮間連接(包括緊密連接、黏附連接和間隙連接)和黏著斑的變化，并且這一過程中可能伴隨著細胞的收縮。在這些生物效應的影響和作用下，內皮間隙形成[26]。內皮間隙的形成往往可以改變血管的完整性，便于大分子物質輸送到血管外組織中。除此之外，像聲空化作用下細胞膜小孔的打開和封閉一樣，內皮細胞之間的連接也存在恢復機制。這一機制也為暫時打開血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)提供了可能[40]。內皮細胞間連接的打開和恢復的程度和動力學既取決于超聲聯合微泡作用的模式和強度也包括微泡與細胞相對位置關系。但是，由于技術原因，目前對于聲空化與內皮細胞間隙變化的動力學之間的關系了解仍不足[26]。除了以上提到可逆小孔的形成、鈣離子內流、細胞骨架的分解和打開細胞與細胞間的連接以外，細胞對聲穿孔的響應也包括活性氧族(Reactive oxygen species,ROS)的釋放[26]。2018年，Jia等[41]發現聲孔作用下細胞中的ROS水平與聲穿孔程度有關。Qin等[26]近期的綜述中對聲空化引發的生物效應進行了全面的回顧。

3 細胞外物質進入細胞的動態過程

不可滲透細胞膜的小分子物質，如碘化丙啶(分子量668 Da)，進入細胞的方式是通過在細胞膜上打開的瞬態的小孔，在濃度梯度的驅動下流入細胞內部[7,38]。進入細胞內的小分子物質往往呈連續均勻分布，如圖5(a)所示。小孔閉合后，其在細胞內分布的動態變化可以用二維無源擴散問題進行擬合，在幾分鐘之內達到平衡狀態[23]。通過小孔是不可滲透細胞膜的小分子物質經聲空化介導進入細胞的最主要的方式(小分子物質的進入位置與微泡的位置完全對應，且沒有微泡處沒有小分子物質的進入)。而隨著細胞外物質的分子量的增加(如分子量為4 kDa和2 MDa的右旋糖苷，直徑分別約為1.23 nm和32.78 nm)，在經過超聲和微泡作用后，其進入細胞的總量逐漸減少，其在細胞內的分布越來越不均勻，呈現出離散的斑點狀，與微泡位置的對應關系逐漸減弱[20,32,42](圖5(b))。

質粒DNA是環狀DNA鏈，一般有多于1000個堿基對，分子量大于1 MDa，直徑大約在幾百納米。與小分子物質相比，質粒DNA在空化作用下進入細胞的方式更為多樣，有效的進入時間更長。Mehier-Humbert等[43]觀察到與脂質轉染(借助內吞作用)相比，超聲和微泡作用后，質粒DNA快速地大量地出現在細胞質中(因此作者推測是由小孔進入)，但是沒有保護的質粒DNA也更快地被DNA酶降解。Liu等[44]觀察到了約30%的質粒DNA在超聲和微泡作用后30 min以離散的斑點狀出現在細胞(包括細胞核)中。Rong等[25]捕捉到在有靶向微泡附著的位置上，質粒DNA正在跨越細胞膜(圖5(c))，證明了小孔是質粒DNA進入細胞的一種可行途徑；同時還觀察到細胞內有多處的質粒DNA與微泡的位置無關，且在較低聲壓，無聲孔效應的條件下，也有質粒DNA快速的進入到細胞內。因此該論文得出結論超聲和微泡介導的質粒DNA進入細胞的過程是一個快速的、發生在全細胞尺度的、激發多種過膜機制的(打開小孔、內吞作用和尚未闡明的快速全細胞尺度的進入方式等)動態過程。

圖5 不同尺寸物質進入細胞的過程Fig.5 The process of substances of different sizes entering the cell

4 臨床試驗的進展

癌癥組織一般具有致密的結締組織基質，不僅壓迫血管減少了血液灌流[45](從而減少了藥物輸送)，而且使得藥物難以穿透基質抵達癌細胞[46]。此外由于癌細胞的無限增殖，癌組織內部的滲透壓升高[47]，進一步抑制了基于擴散的藥物遞送。癌組織的這些病理特點嚴重降低了化療藥物的遞送效率。化療藥物主要的作用機制是抑制細胞生長、誘導細胞凋亡，因此對正常細胞具有較大的副作用。靶向給藥技術與化療藥物的聯合使用，能夠增強癌組織對化療藥物的攝取，同時降低化療藥物對全身健康細胞的副作用，因此靶向給藥技術對于基于化療的癌癥治療具有重要的臨床應用價值。

增厚的、致密的和藥物幾乎無法穿透的基質是胰腺癌的顯著特征，迫切需要靶向給藥技術增強化療效果。2013年，Kotopoulis等[48]報道了超聲、微泡、吉西他濱針對胰腺癌的聯合使用，結果顯示該療法增加了患者耐受化療的周期數，延長了患者的生存期。2016年，Dimcevski等[49]開展了超聲、微泡、吉西他濱聯合使用治療胰腺癌的臨床試驗，評估了治療的安全性、潛在毒性以及患者的中位生存期，證實了該療法不會引起額外的毒性或增加化療藥物原有的副作用，延長了患者的壽命，如圖6所示。2018年，Wang等[50]報道了一項在我國開展的針對胰腺癌肝轉移患者，采用超聲、微泡和化療藥物聯合使用的臨床研究，未引發患者產生其他毒副作用，表明該療法具有良好的安全性。目前，更大規模的臨床試驗正在我國開展中。

圖6 利用超聲和微泡治療胰腺癌的臨床試驗Fig.6 Clinical trial using ultrasound and microbubbles in the treatment of pancreatic cancer

在進行腦部疾病的藥物治療時，血腦屏障的存在是藥物進入腦部患處的巨大障礙。超聲聯合微泡技術憑借其可實現聲空化的特點能夠短暫和局部打開血腦屏障，為解決這一問題提供了新的選擇[51]。同時，這也為靶向輸送化療藥物到腦部腫瘤處提供了新的途徑。目前已經進行了大量的預臨床實驗，例如2013年，Fan等[52]通過將抗惡性神經膠質瘤藥1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(BCNU)封裝在與VEGF-A配體偶聯的靶向微泡中，實現靶向藥物的輸送和釋放，減少了腫瘤發展；2014年，Burke等[53]將納米粒子(Nano-particles,NP)藥物載體偶聯到MBs形成MB-NP復合劑(MB-NP composite agents,MNCA)，改善了納米載體的遞送并且在超聲的作用下增加了NP向腫瘤的遞送，抑制了腫瘤生長，小鼠存活率顯著提高。臨床試驗也正在進行中，2016年，Carpentier等[54]開展的臨床試驗中證明了脈沖超聲聯合微泡技術對于復發成膠質細胞瘤患者是安全且耐受性良好的。

除了利用超聲聯合微泡技術研究胰腺癌和腦腫瘤之外，人們也將目光投向其他癌癥希望能夠通過這項技術實現抗腫瘤藥物的增敏效果，提高化療藥物對腫瘤組織的殺傷效果。目前針對于原發性結腸癌導致的肝轉移和乳腺癌患者的臨床試驗也正在進行中[51]。

超聲和微泡的聯合使用是一項具有廣泛應用性的靶向給藥技術，除了用于增強化療藥物的靶向提送、提高癌癥治療效果以外，其他活躍的研究領域還包括：用于增加血腦屏障的通透性，提高針對神經和精神類疾病藥物在大腦的富集；促進針對心血管疾病藥物的靶向遞送；增加血管-脊髓屏障的滲透性，提高藥物進入脊髓的效率；增加藥物的經皮給藥效率等。Stride等[55]近期的綜述對超聲聯合微泡在臨床應用中的進展進行了回顧。

5 總結與展望

超聲聯合微泡增強藥物遞送技術經過20余年的發展，在微泡聲空化的物理機制、細胞的各種生物響應、藥物進入細胞的動力學特征等方面均取得了豐富的研究成果，使得人們對該技術發生機理的認知不斷加深。目前，該技術已經進入臨床試驗的階段，安全性和有效性得到了初步的驗證。

圍繞機理性研究，作者有以下幾點建議和思考。(1)在更為接近體內環境的實驗條件下開展機理性研究。目前已有的機理性研究中所用的細胞均為懸浮狀態或為附著于硬質基底上的單細胞層。這與細胞的體內生存狀態(如附著在細胞外基質上、暴露在一定的物理化學分子條件中、與組織中其他細胞相互作用等)相差很大。而且體內具有復雜的三維結構。以癌癥治療為例，經靜脈注射進入血液循環后，微泡需要首先在目標組織中跨越血管壁(同時盡量避免出血)，穿越細胞外基質后，抵達癌細胞。隨后，微泡在超聲照射下，增加癌細胞的通透性。隨著組織工程、生物材料、3D打印等技術的發展，構建出能夠反映體內三維結構的體外組織模型，并在其中開展機理性研究，將大大推進人們對于該技術在體內的發生機理的認識，更好地指導臨床試驗中治療策略的制定、參數設計等工作，提高治療效果。(2)深入研究在穩態聲空化下更為廣泛的生物效應。由于臨床應用的基礎是保障安全(盡量避免出血、健康組織不可逆的損傷等)，因此臨床應用更青睞安全性更好的較低的超聲照射。目前已有的機理性研究多聚焦于聲孔效應，未來可加大在較低超聲強度下穩態聲空化引發的更為廣泛的生物效應，比如激發免疫細胞活性、抑制癌細胞癌變進程或者遷移能力和降低癌組織基質細胞的分泌能力等。這些生物效應可能是間接但安全有效地增強藥物靶向遞送的途徑。(3)探究減小聲空化所帶來的不良生物效應的措施。在將超聲聯合微泡的靶向給藥技術不斷向臨床應用推進的進程中，大量細胞死亡、出血等是超聲空化所引起的各種不良生物效應[26,56]。除了調整微泡劑量和超聲參數來減小不良生物效應外，也可以采用縮短空化作用下膜孔的開啟和閉合的窗口時間的方法。該方法有助于提高基于聲孔效應的藥物遞送的效率和安全性[26]。例如，可以考慮從生化角度去影響膜閉合，利用細胞內Ca2+水平觸發細胞的內吞和胞吐作用進而促進膜孔封閉的特點，來影響Ca2+相關的信號通路[26]。此外，采用更小的微泡也有可能減小不良生物效應。與作用于細胞和組織微米級小泡相比，直徑在1μm以下的納米小泡可以滲透過血管壁，并可能在癌組織基質中有更深的滲透深度，因此很有可能能夠減少出血。納米級微泡的制備技術在近年來發展很快。納米級小泡尺寸過小，且包含氣體，因此在發展之初難以觀察和研究其動態響應等。關注納米級微泡的聲學響應及藥物遞送機理是十分必要的。相信成像技術的快速發展必將允許人們對納米級小泡的聲學響應及藥物遞送機理開展更為深入的研究。

與此同時，一些新的工程方法的引入，擴展了基于聲空化的細胞藥物遞送的實現方式，推進了其向著高度可控、高通量的體外細胞轉染技術的方向發展。Li等[57]利用聲子晶體增強的近壁聲流實現了可逆的聲孔效應。Belling等[58]利用在毛細管中的聲流實現了高通量的基于聲孔效應的向多種人類細胞的基因轉染。

總之，作為一項非侵入式的、非病毒的藥物遞送技術，超聲和微泡的聯合使用在臨床應用上具有獨特的優勢(具有良好的靶向性、可實現實時圖像引導等)。經過20余年的發展，人們已經在其發生機理上積累了相當的認知。同時也應該客觀地認識到，目前的臨床試驗結果和理想的治療效果之間還存在很大差距。未來，需要在臨床醫生、物理學家、化學家和生物學家的共同努力下，不斷提高該技術的安全性、靶向性和有效性，最終使患者受益。