超聲輔助提取微藻油脂機理及工藝參數的研究?

張仕雙 李彬彬 傅波

(四川大學機械工程學院 成都 610065)

0 引言

受化石能源的不可再生性、日益減少的存儲量以及對環境的污染等影響，可再生能源引起世界各國的廣泛關注[1]。生物質能源是人類應對能源危機和環境惡化時提出的解決方案之一。其中生物柴油是將生物體內的油脂經酯交換反應而形成以脂肪酸甲酯為主要成分的一種生物質液體燃料，是近年來生物質能源研究的熱點。在制備生物柴油的眾多原料中，微藻憑借油脂含量高、生長速度快、培養不占用耕地等優點被認為是生物質能源的重要原料[2?3]。

在微藻的能源轉化過程中，將微藻植物油經酯交換反應制得生物柴油的技術已經成熟；但是，由于微藻細胞壁比較堅固，微藻中油脂的提取仍然面臨巨大的挑戰[4]。超聲波破碎法是一種有效的細胞破碎方法，廣泛應用于油脂浸取、多糖提取以及天然藥物活性成分提取[5]。郭孝武等[6]介紹了利用超聲提取分離技術在蘋果、紅花、橘皮、小球藻等植物中提取油脂的應用以及相關工藝參數。Araujo等[7]設置不同實驗組，研究超聲對微藻油脂提取的影響，結果表明超聲波處理能有助于細胞壁破碎，提高了提取效率。Santos等[8]通過實驗對幾種小球藻油脂的提取方法進行比較，結果表明在超聲波輔助作用下，利用有機溶劑氯仿:甲醇(2:1)的混合物作為溶劑是從微藻類中提取脂類物質最有效的方法。Ellison等[9]介紹了一種對微藻類進行處理的新技術路線，研究了超聲功率和處理時間對微藻油脂提取的影響，結果發現超聲功率越高，處理時間越長，細胞破碎越徹底，油脂產量越高。岳敏等[10]研究了超聲功率、超聲處理溫度以及時間等因素對細胞破壁率的影響，得出一組優化的超聲破壁參數。

現有研究主要是采用固定的超聲設備進行實驗，研究超聲電功率、時間以及萃取試劑等因素對提取率的影響，而對超聲輔助提取微藻油脂的機理、超聲振動子的結構設計以及超聲頻率、超聲振動子工具頭浸入溶液深度等工藝參數如何影響微藻細胞破碎率等方面較少涉及。本文分析了超聲波對微藻細胞的作用機理，建立了基于聲沖流、聲輻射力、聲空化的傳質動力學的經驗模型，設計了幾種常見縱振頻率的超聲振動子，研究超聲頻率、超聲電功率、工具頭浸入溶液深度、超聲處理時間、萃取試劑等因素對微藻細胞破碎率的影響，獲取超聲提取微藻油脂的最佳工藝參數。

1 超聲輔助提取微藻油脂機理

超聲振動子將電能轉變為超聲振動，在溶液中形成聲沖流、聲輻射力以及聲空化效應[11]。聲空化效應形成的空化泡在振蕩或破裂的過程中會在局部產生瞬時的高溫、高壓，同時產生強烈沖擊波和剪切力，對周圍的細胞有沖擊撕裂的效果，破壞生物細胞壁和細胞膜，有利于細胞內容物釋放到提取液中[12]。高頻振動產生的聲沖流與聲輻射力在提取液中產生的沖流、渦流以及湍流促進微藻細胞與溶劑形成對流，具有攪拌作用，加快提取進程。

微藻油脂的物理提取是有效成分從固相向液相傳遞的動力學過程，其實質是傳質動力學理論。Fick第一定律表達式為

式(1)中，D表示擴散系數，S表示擴散面的面積，c表示擴散物質的體積濃度，dc/dx表示溶質濃度梯度，“?”號表示擴散方向與濃度梯度的方向相反，dn/dt表示溶質擴散速率。

微藻細胞中溶質的濃度隨著時間的增加而不斷下降的同時，擴散邊界層的濃度也隨時間減小，其變化曲線可用冪函數表示：

在超聲振動提取時，擴散系數D由兩種擴散系數組成，分別為分子擴散系數DM和渦流擴散系數DE[13]：

其中，

式(4)中，K表示影響系數，E表示擴散活化能，R表示普適氣體常量，T表示溫度，q表示濃度的參數。

考慮到聲空化、聲沖流、聲輻射力所產生的微射流、渦流以及湍流現象，對渦流擴散系數DE進行定義：

式(5)中，vs表示由聲沖流引起的渦流速度，vf表示由聲輻射引起的振動速度，vc表示聲空化引起的射流速度；k1、k2、k3、k4分別表示聲沖流系數、聲輻射振動系數、聲空化系數以及各因素之間的相互影響系數。

將式(4)、式(5)帶入式(3)可得

超聲作用于溶液，溶液中物質破碎產生的附加表面積能提高傳質率[14]。超聲振動將細胞壁破碎，增大細胞中的溶質與溶液的接觸面積，根據文獻[15]研究結果對擴散面的面積S進行修正：

式(7)中，S0表示超聲作用前的擴散面積，t表示時間，μ表示與微藻顆粒形狀相關的系數，P表示超聲功率。

微藻細胞的總數為ω，其顆粒線度為σ，總質量為G，其密度為ρ，可得

其中，k、k′是與細胞形狀和線度有關的常數，化簡后得

式(11)中，Y表示細胞吸收溶劑的速率，對于特定的細胞Y是一定值。

將式(2)、式(6)、式(7)、式(8)、式(11)、式(12)代入式(1)，結合邊界條件：在t=0時，c=0；在t≠時，n=Vc，n表示溶質物質的量，V表示溶液體積。進行積分化簡得到超聲微藻油脂提取的傳質動力學方程：

以上方程表明，擴散物質的體積濃度受超聲電功率、作用時間等工藝參數的影響，為了提高微藻細胞的破碎率及油脂的提取率，需選取恰當的超聲輔助工藝參數。

2 超聲振動子的設計

超聲振動子主要由換能器、變幅桿和工具頭組成，結構示意圖如圖1所示。在工作區內要破壞微藻細胞壁，縱向振動的振幅應不低于25μm，換能器的縱振頻率應在20 kHz以上[16]。因此，本文設計常見的共振頻率20 kHz、25 kHz、28 kHz振動子。

圖1 超聲振動子結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of ultrasonic vibrator structure

傳輸矩陣法作為一種壓電超聲振動子的設計建模方法，因其簡明有效的特性被許多研究采用[17]。將超聲振動子等效成多個單一截面桿的串聯，對各個單一截面桿建立四端網絡，得到若干個傳輸矩陣，忽略機械損耗及預應力螺栓的影響，最后再將所有的四端網絡串聯起來，即可得到超聲振動子整體的傳輸矩陣方程[18?19]：

根據邊界條件以及上述的傳輸矩陣方程，計算出振動子各段的尺寸。用有限元分析軟件對振動子的各段進行模態分析及優化，優化后的28 kHz超聲振動子實物圖如圖2所示。

圖2 28 kHz超聲振動子實物圖Fig.2 Physical map of 28 kHz ultrasonic vibrator

3 實驗

3.1 實驗平臺

在超聲破碎實驗中，利用坐標支架來固定超聲振動子，通過電機與絲杠可以實現超聲振動子的垂直與水平方向的移動。利用超聲電源和PC機調節超聲破碎時的電功率和頻率。圖3為搭建好的超聲破碎實驗平臺。

圖3 超聲破碎系統實驗平臺Fig.3 Experimental platform of ultrasonic crushing system

實驗儀器主要包括WG-1000W型超聲電源、PC機、超聲振動子(諧振頻率分別為20 kHz、25 kHz、28 kHz)、PV80A阻抗分析儀、坐標軸移動平臺、BMC500系列生物顯微鏡、FA2004型電子天平、TD5A型離心機、燒杯(規格500 mL、杯身直徑90 mm)。

實驗材料與試劑主要有干燥的剛毛藻顆粒與扁藻顆粒、正己烷試劑、無水乙醚/石油醚(1:2)混合溶劑、氯仿試劑、蒸餾水。

3.2 實驗方法

利用超聲破碎實驗平臺，研究超聲振動的頻率、電功率、超聲處理時間以及振動子工具頭浸入溶液的深度等工藝參數對微藻細胞破碎率的影響。采用阻抗分析儀分別測量振子在空氣負載和水負載下的導納圓直徑，根據電聲效率計算公式(16)計算，得到28 kHz超聲振動子的電聲效率為73.4%。

其中，Dw為水負載時導納圓的直徑，Da為空氣負載時導納圓的直徑，G0為水負載時諧振頻率下的電導[20]。

為了評價細胞破碎率，用膠頭滴管、量筒量取1 mL處理前的微藻溶液，通過高倍電子顯微鏡與血球計數板統計微藻溶液中微藻細胞的個數。再按照實驗方法用滴管吸取超聲破碎后的溶液，在顯微鏡下觀察統計未被破碎的細胞個數。為提高實驗的準確度，多次統計求取平均值，計算出細胞的破碎率，計算公式為

式(17)中，ψ表示細胞破碎率，Ni表示超聲處理前計算細胞數目，Nj表示超聲處理后計算細胞數目的平均值，在本實驗中n=5，表示統計次數為5。

3.2.1 處理時間與超聲電功率對細胞破碎率的影響

設置4個實驗組，超聲電功率分別設置為75 W、150 W、225 W、300 W。用電子天平稱取25 g剛毛藻放入燒杯中，加入160 mL蒸餾水，微藻溶液的總深度為55 mm，工具頭浸入溶液的深度是25 mm，采用縱振頻率為28 kHz的振動子進行破碎實驗，每隔5 min采集一次數據。

3.2.2 振動子頻率對細胞破碎率的影響

設置3個實驗組，縱振頻率分別為20 kHz、25 kHz、28 kHz的超聲振動子，用電子天平稱取25 g剛毛藻放入燒杯中，加入160 mL蒸餾水，微藻溶液的總深度為55 mm，振動子浸入燒杯的深度為30 mm，超聲電功率設置為225 W，每隔10 min采集一次數據。

3.2.3 工具頭浸入溶液的深度對細胞破碎率的影響

設置8個實驗組，利用PC機控制坐標平臺的z軸上下移動從而改變工具頭浸入溶液深度，浸入深度值分別為5 mm、10 mm、15 mm、20 mm、25 mm、30 mm、35 mm、40 mm。用電子天平稱取25 g剛毛藻放入燒杯中，加入160 mL蒸餾水，超聲振動子的工作頻率為28 kHz，超聲電功率設置為225 W，微藻溶液的總體深度是55 mm，每個浸入深度值超聲處理時間為10 min，每隔5 min采集一次數據。

3.2.4 不同試劑萃取油脂效果的比較

用電子天平稱取25 g剛毛藻加入160 mL的蒸餾水，采取前述獲得的超聲振動工藝參數進行細胞破碎處理。破碎結束后用吸管取出3份樣品，每份樣品15 mL，放入離心管中。在樣品1中加入15 mL的甲醇和15 mL三氯甲烷，在樣品2中加入30 mL無水乙醚/石油醚(1:2)的混合溶劑，在樣品3中加入30 mL的正己烷。提取期間至少搖4次，提取時間為1 h，充分靜置。用離心機以4500 r/min的轉速離心樣品溶液5 min，用注射器取出樣品1下層溶液，樣品2、樣品3的上層溶液。對3份樣品重復上述步驟，使油脂充分得到提取。合并取出的溶液，將溶液放入帶蓋試管中進行水浴加熱，得到粗油脂。

3.2.5 兩種常見微藻的油脂含量測定

剛毛藻和扁藻是兩種常見的微藻，在高倍顯微鏡下面這兩種微藻的細胞形狀如圖4所示。

圖4 微藻細胞Fig.4 Microalgae cells

各取10 g剛毛藻與扁藻，加入160 mL的蒸餾水，在縱振頻率25 kHz、電功率225 W條件下，超聲破碎處理25 min。用吸管各吸取16 mL微藻破碎溶液，加入16 mL甲醇混合均勻，再加入16 mL三氯甲烷混勻，進行萃取，其間至少搖勻4次，萃取時間為1 h。離心5 min，用注射器取出下層液體，再在上層液體中加入16 mL三氯甲烷混勻進行萃取1 h，離心5 min，用注射器取出下層溶液，重復上述步驟，使充分提取。合并下層液體，置于稱量皿中，通風廚過濾去除三氯甲烷，放置24 h。

4 結果與討論

4.1 處理時間與超聲電功率對細胞破碎率的影響

超聲電功率分別設置為75 W、150 W、225 W、300 W的實驗組的實驗數據如表1所示。為了更直觀地觀察到超聲電功率與超聲處理時間對剛毛藻破碎率的影響，繪制折線圖，如圖5所示。

表1 不同超聲電功率實驗數據Table 1 Experimental data of different ultrasonic electrical power

根據表1和圖5可以觀察到，超聲電功率為75 W的實驗組在前20 min時間內，細胞破碎效果不明顯，破碎率不足40%，相同的條件下，超聲電功率分別為150 W、225 W、300 W的實驗組細胞破碎率超過80%。說明75 W的超聲電功率過低，超聲振動子在提取溶液中所產生的超聲波強度低，聲空化效應微弱，所產生的空化泡數量少，空化泡破裂所產生的沖擊波與剪切力，不能快速對剛毛藻細胞壁造成損傷。超聲電功率分別為150 W、225 W、300 W的實驗組在超聲處理25 min時間內，隨著處理時間增加，剛毛藻細胞破碎率增長迅速，均達到90%，但增加的趨勢到25 min以后比較平緩，實驗組之間差距不明顯。原因是超聲波強度增加到一定值，空化趨于飽和。通過生物顯微鏡觀察到超聲功率設置為225 W的實驗組在處理時間分別為0 min、6 min、12 min、18 min時剛毛藻細胞的形狀如圖6所示。可以觀察到在未對細胞進行處理時，剛毛藻細胞排列整齊，細胞壁厚實，細胞內容物清晰可見。隨著處理時間的增加，剛毛藻細胞排列混亂，細胞內容物逐漸減少，完整的剛毛藻細胞越來越少。考慮到超聲振動子的功耗因素，較為合理的超聲電功率為225 W，處理時間為25 min。

圖5 細胞破碎率與超聲電功率、時間的關系Fig.5 Relationship between cell disruption rate and ultrasonic electrical power and time

圖6 不同處理時間的細胞形狀Fig.6 Cell shape at different treatment times

4.2 振動子頻率對細胞破碎率的影響

超聲頻率分別為20 kHz、25 kHz、28 kHz的實驗組的實驗數據如表2所示。為了更為清晰直觀地觀察到超聲頻率與剛毛藻破碎率的關系，繪制折線圖，如圖7所示。

表2 不同超聲頻率實驗數據Table 2 Experimental data of different ultrasonic frequencies

由圖7可以觀察到，在相同的條件下，剛毛藻細胞破碎率隨著超聲振動子的縱振頻率的增大而增大，縱振頻率為20 kHz時，細胞破碎效率較低。說明超聲頻率越高，所產生的聲輻射力越大，引起的振動速度越大，對細胞壁的破壞更加劇烈。頻率增大到一定值時，破碎率隨著縱振頻率的增加而增加得比較緩慢。從實驗結果來看，在相同實驗條件下，28 kHz與25 kHz時的細胞破碎率相差不大，并且隨著超聲頻率的提高，產生空化效應的閾值也就越高，產生空化效應所需電功率就越大。根據超聲輔助提取微藻油脂理論分析，相比于高頻振動產生的聲沖流以及聲輻射作用，更希望獲得更好的聲空化效應。因此，縱振頻率選為25 kHz較為合適。

圖7 細胞破碎率與超聲頻率的關系Fig.7 Relationship between cell breakage rate and ultrasonic frequency

4.3 工具頭浸入溶液的深度對細胞破碎率的影響

工具頭浸入溶液中不同深度與剛毛藻細胞破碎率的實驗結果如表3所示，為了更為清晰直觀地觀察到浸入深度與剛毛藻破碎率的關系，繪制折線圖，如圖8所示。

圖8 細胞破碎率與浸入深度的關系Fig.8 Relationship between cell breakage rate and immersion depth

表3 不同深度下的實驗數據Table 3 Experimental data at different d ep ths

由圖8可以觀察到，在超聲振動時間相同的情況下，剛毛藻細胞破碎率隨著浸入深度的增加呈現先增加后減小的趨勢，在工具頭浸入剛毛藻溶液總深度的二分之一左右時，細胞破碎率達到最大。原因是工具頭浸入溶液總深度的二分之一時，聲壓分布較為均勻；而工具頭浸入微藻溶液較深時，底部的壓強太大，超聲波產生的能量損耗比較大，對剛毛藻細胞壁的破壞作用遭到削弱。因此，超聲振動子的工具頭浸入溶液的最佳深度應為二分之一總深度。

4.4 不同試劑萃取油脂效果的比較

3份樣品在添加萃取劑并充分融合靜置后如圖9所示。樣品1為氯仿試劑萃取效果，樣品2為無水乙醚/石油醚(1:2)的混合溶劑萃取效果，樣品3為正己烷試劑萃取效果。通過離心機以4500 r/min的轉速離心，并水浴加熱去除溶劑后，得到的粗油脂如圖10所示。

圖9 樣品溶液Fig.9 Sample solution

圖10 提取的油脂樣品Fig.10 Extracted oil sample

根據圖9與圖10可以觀察到，正己烷試劑萃取靜置分層不明顯，從提取到的粗油脂樣品量來分析，氯仿的萃取效果最好，無水乙醇-石油醚次之，正己烷的萃取效果最差。因此，選擇氯仿試劑作為提取微藻油脂的試劑。

4.5 兩種常見微藻的油脂含量測定

獲得的剛毛藻以及扁藻的油脂如圖11所示，圖11(a)是從扁藻中提取的油脂，質量為0.0674 g，其提取率為6.74%，圖11(b)是從剛毛藻中提取的油脂，質量為0.0815 g，其提取率為8.15%。可以得出剛毛藻的油脂含量要比扁藻的油脂含量高。

圖11 粗油脂Fig.11 Crude oil

5 結論

本文闡述了超聲輔助提取微藻油脂的機理，從超聲振動處理時間、超聲頻率、超聲電功率以及超聲振動子的工具頭浸入溶液深度等因素分析了超聲波對微藻細胞破碎率的影響，獲得了超聲輔助提取微藻油脂的最佳工藝參數。實驗結果表明：對于所研究的微藻溶液，超聲振動最佳工藝參數為縱振頻率25 kHz、電功率225 W、浸入溶液總深度的二分之一、超聲振動處理25 min。在對破碎后的微藻溶液的萃取方法中，氯仿的萃取效果最好。對于常見的剛毛藻和扁藻，采用本文的超聲輔助提取方法進行油脂提取，剛毛藻的油脂提取率更高。超聲波在微藻油脂提取過程中具有顯著的優點，如細胞破碎效率高、加工時間短、能耗低等。合理地利用超聲輔助油脂提取的最佳工藝參數對于利用微藻進行產業化制備生物柴油以及相關高效能源轉化裝備的設計具有指導意義。