南湖菱殼中五沒食子酰葡萄糖提取工藝及其抗腫瘤活性研究

張牧原 李軍 黃佳 吳霽蓂 蔣琦 高廣春

摘要：為明確菱殼中五沒食子酰葡萄糖的最佳提取工藝條件，在單因素試驗的基礎上采用響應面法，以提取率為評價指標研究提取工藝，并采用CCK8法對最優單因素和最佳提取工藝條件下的提取物進行了抗SK-BR-3腫瘤細胞增殖的研究。結果表明，影響提取率的因素依次為提取溫度>乙醇濃度>超聲時間，乙醇濃度和提取溫度的交互作用最強，對提取率的影響最為顯著;最佳的提取工藝為料液比1 g ∶20 mL，乙醇濃度67%，提取溫度80 ℃，超聲時間 10 min，預測提取率為0.674 2%，實際提取率為0.675 5%，結果相符。各部分提取物對SK-BR-3乳腺癌細胞增殖具有顯著的抑制作用，并且呈現一定的時間和濃度依賴性。在濃度為100 μg/mL時，各部分提取物對受試細胞具有極顯著的抑制增殖作用（P<0.01）。

關鍵詞：響應面法;南湖菱殼;五沒食子酰葡萄糖;抗腫瘤活性

中圖分類號：TS201.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0173-07

南湖菱（Trapa acornisNakano）為菱科一年生水生草本植物，又稱青菱、餛飩菱、元寶菱，主要生長在嘉興南湖水域，是嘉興的一種特色農產品。菱殼是菱角的非食用部分，資料顯示南湖菱殼在民間食療偏方里可用于治療生殖系統和消化系統腫瘤[1]，藥理研究表明菱殼提取物具有抗腫瘤、保肝護肝、抗氧化和降血糖的功效。本項目組在前期研究中對嘉興本地的菱殼化學成分進行了HPLC和UPLC-MS分析鑒定，發現其乙醇水提取物中含有沒食子酸、1，3，6-三沒食子酰葡萄糖、1，2，3，6-四沒食子酰葡萄糖、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖類化合物（pentagalloylglucose，PGG）。沒食子酸和沒食子酰葡萄糖類化學成分是一類重要的多酚類化合物，這類化合物有很強的生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抑菌、抗過敏、降血糖等功能。由此推斷菱殼臨床療效的化學物質基礎為沒食子酸及沒食子酰葡萄糖類多酚成分。隨著PGG豐富的藥理學活性被發現，其生物來源和制備方法的研究也越來越多，據報道其存在于多種植物的根、莖、葉、種子和果實等部位，但未見其在菱科植物中的報道。菱殼作為菱角果實的廢棄物，提取原料成本廉價，如果能利用其作為原料提取PGG，將大大提高菱角的經濟價值，也有助于緩解中藥資源的短缺。本項目組一直以來從事菱殼多酚提取制備工藝和抗腫瘤活性的研究，在前期研究的基礎上本研究將采用超聲輔助提取南湖菱殼中的多酚類化學成分，以PGG的提取率作為評價指標通過響應面法優化其提取工藝，并利用CCK8法測定提取物對HER2陽性乳腺癌細胞SK-BR-3的細胞毒活性。本研究為南湖菱資源的綜合開發利用提供理論基礎，也為菱殼多酚藥用價值的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年10月于嘉興采收南湖菱，新鮮剝取菱殼后清洗干凈，于陰涼處晾干后粉碎過60目篩備用。1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖對照品（純度≥ 98%）購于上海雅吉生物科技有限公司。色譜甲醇、無水乙醇、乙酸、蒸餾水購于華東醫藥有限公司。SK-BR-3人乳腺癌細胞購于上海銳賽生物技術有限公司。DMEM培養基、CCK8檢測試劑盒（Dojindo，CK04）購于上海復申生物科技有限公司。試驗于2018年9月至2019年12月在嘉興學院醫學實驗中心完成。

1.2 試驗儀器與設備

細胞培養箱（賽默飛世爾科技），Agilent1200高效液相色譜儀（杭州瑞析科技有限公司），色譜柱Eclipse XDB-C18（250 nm×4.6 mm，5 μm 上海楚定分析儀器有限公司），Thermo MuLTiSKAN MK3酶標儀（上海智巖科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 南湖菱殼多酚的提取

1.3.1.1 供試樣品的制備 精確稱取0.5 g菱殼粉末，按單因素及響應面設計的條件進行超聲提取。將提取液過濾后離心20 min，準確移取上清液 1 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾后得菱殼多酚提取液。

1.3.1.2 單因素試驗設計 精確稱取0.5 g樣品于具塞三角燒瓶中，選取不同的乙醇濃度（10%、30%、50%、70%、90%），不同的浸提溫度（40、50、60、70、80 ℃），不同的超聲時間（10、15、20、25、30 min），不同的料液比（1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL，1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL）等因素浸提菱殼中的多酚類物質，分析不同的因素對提取菱殼多酚類成分的影響。每處理設3次重復。

1.3.1.3 響應面法優化PGG提取工藝 依據單因素試驗結果，設計3因素3水平的響應面試驗，確定PGG最佳提取工藝條件。

1.3.2 HPLC法測定PGG的提取率

1.3.2.1 高效液相色譜條件 檢測波長280 nm，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。流動相A為甲醇，流動相B為乙酸水溶液;梯度洗脫：0～5 min，12%～20% A;5～15 min，20% A;15～25 min，20%～70% A;25～30 min，70% A。

1.3.2.2 標準曲線的建立 精確稱取PGG標準品 8 mg，置于25 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，振蕩搖勻，得標準品貯備液。分別移取一定量的儲備液于另一10 mL容量瓶中，甲醇定容，振蕩搖勻后，得質量濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL 的五沒食子酰葡萄糖標準溶液，過045 μm微孔濾膜除去雜質微粒后注入1.5 mL進樣瓶中依次編號，在 280 nm 處測定吸收峰，平行測定3次。以峰面積為縱坐標，進樣質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程y=13.283x-122.6（r2=0.999 3），五沒食子酰葡萄糖（12.5～400.0 μg/mL）與峰面積的線性關系良好。

1.3.2.3 供試樣品PGG提取率的測定 將供試樣品按照色譜條件進行色譜分析，每樣品平行測定3次，記錄峰面積，用峰面積和線性回歸方程計算得PGG提取率。

y（五沒食子酰葡萄糖）=13.283x-122.6;

提取率（%）=C×V/w×106。

式中：y為峰面積，x、C為多酚含量（μg/mL），V為溶液體積（mL），w為南湖菱殼粉末的質量（g）。

根據單因素試驗中PGG提取率確定響應面法試驗適當的因素和水平。

1.3.3 細胞毒活性測定 采用CCK-8法測定4個最優單因素提取條件和最佳提取工藝條件下得到的提取物。對4個樣品進行編號：最優乙醇濃度提取物（A），最優超聲時間提取物（B），最優提取溫度提取物（C），最優料液比提取條件（D）和最佳提取工藝條件（E）。取處于對數生長期的細胞以每孔1.0×104個接種于96孔板內，置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養24 h。待細胞充分貼壁后，分別加入不同濃度的菱殼多酚（25、50、100、200、400、800 μg/mL）的提取物，陽性對照為順鉑，每組設3個平行空。藥物處理24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK8，混勻后培養箱中孵育1 h，測定450 nm處吸光度。細胞增殖抑制率=1-藥物組（D）/陰性對照組（D）×100%。

1.3.4 數據分析 采用DesignExpert 8.0.6軟件，利用響應面設計分析方法進行線性回歸和二項擬合，確定最佳提取工藝條件。細胞毒活性測定試驗數據應用GraphPad Prism 5.0進行統計處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對PGG提取率的影響 由圖1-A所示，菱殼中PGG提取率隨乙醇濃度的不斷增大呈現出先升高再降低的趨勢，在乙醇濃度達到70%時，PGG提取率達到峰值。原因可能為低濃度乙醇溶液對菱殼中的水溶性成分如糖類、氨基酸、蛋白質及苷類等物質的提取效果更好。隨著乙醇溶液濃度的升高，其極性逐漸減弱，多酚類物質的溶解度隨之升高;但濃度較大時，其對極性較低的化學成分的提取效果更優，所得總提取物中多酚類物質含量降低。因此，選擇50%、70%、90%等3個乙醇濃度進行響應面法試驗。

2.1.2 超聲時間對PGG提取率的影響 由圖1-B可知，菱殼中PGG的提取率隨超聲時間的不斷延長呈現出先升高再降低的趨勢，在超聲時間達到 15 min 時，PGG的提取率達到峰值。超聲時間過長時，可能其他物質的提取率增加使得總提取物中PGG含量下降，因此選擇10、15、20min等3個超聲時間進行響應面法試驗。

2.1.3 提取溫度對PGG提取率的影響 由圖1-C可知，菱殼中PGG的提取率隨提取溫度的不斷升高而不斷升高，提取溫度達到70 ℃時達到峰值，隨著溫度繼續升高提取率趨于平緩，因此選擇60、70、80 ℃ 等3個溫度進行響應面法試驗。

2.1.4 料液比對PGG提取率的影響 由圖1-D可知，菱殼中PGG的提取率隨料液比的不斷增大呈現出先快速升高然后減緩的趨勢。當料液比為 1 g ∶20 mL 時，提取率較高，繼續增大料液比提取率上升不明顯，考慮到實際生產時料液比增大會導致后期濃縮耗能耗時從而降低效率，故選擇料液比1 g ∶20 mL作為響應面法試驗的最佳工藝條件。

2.2 響應面法優化菱殼中PGG的提取工藝

2.2.1 因素水平表 根據單因素試驗結果，選取乙醇濃度（X1）、浸提溫度（X2）、超聲時間（X3）3個因素作為自變量，確定出響應面試驗的3因素3水平條件（表1）。

2.2.2 響應面實驗設計和結果 響應面法試驗方案和結果見表2。試驗數據實際測得值與擬合方程預測數值大部分都很接近，個別有所差別，但差別不大，均在誤差范圍內。

2.2.3 響應面法的模型評價及分析 使用Design-Expert軟件對表2數據進行二次多項式逐項回歸模擬，可得到數學模型Y=0.63-0.029A+0.038B+0003 1C+0.029AB+0.019AC-0.003 65BC-0063A2-0.003 713B2+0.009 863C2。式中：Y為PGG提取率，A為乙醇濃度，B為提取溫度，C為超聲時間，P=0.0001，失擬項為0.064，R2=0.973 6。數學模型的方差分析和各項式系數顯著性分析結果見表3。從表3可知，回歸方程方差分析多項式回歸方程中的P=0.000 1<0.05，回歸方程模型較為可靠;失擬項為0.064>0.05，失擬不顯著;方程的擬合相關系數R2=0.973 6>0.9，表示估計值和預測值之間的匹配度較高。在選取的因素水平范圍內，比較各因素的F值，A=0.003，B<0.000 1，C=0.503 3，可知各因素對試驗結果的影響大小順序為B（提取溫度）>A（乙醇濃度）>C（超聲時間）。方差分析結果表明，方程的模型對PGG的提取率影響極顯著（P<0.01）。

圖2-A的響應面曲線最為陡峭，反映出乙醇濃度和提取溫度的交互作用對PGG提取率的影響極為顯著，當乙醇濃度和提取溫度適當增加時，PGG的提取率增加且有穩定的最大值，因此，適當增加乙醇濃度和升高浸提溫度有助于提高PGG的提取率。圖2-C的響應面曲線較為陡峭，乙醇濃度和超聲時間的交互作用對PGG提取率的影響顯著，當超聲時間一定時，適當增加乙醇濃度，PGG的提取率隨之升高，繼續增加乙醇濃度，其提取率增加趨勢逐漸變緩甚至略有下降。圖2-E的響應面曲線平緩，表明提取溫度和超聲時間的交互作用對PGG提取率的影響不顯著。由圖2-B、圖2-D、圖2-F

可知，乙醇濃度和提取溫度的交互作用等高線為橢圓形，表明交互作用最強，對PGG的提取率影響極為顯著;乙醇濃度和超聲時間的交互作用等高線為橢圓形，表明交互作用較強，對PGG的提取率影響顯著;提取溫度與超聲時間的交互作用等高線沒有明顯的呈現橢圓形，更接近圓形，表明交互作用不強，對PGG的提取率影響不顯著。

通過最優化分析得到最佳提取條件為提取溫度80 ℃，乙醇濃度67%，超聲時間10 min，預測PGG提取率為0.674 2%。為檢驗結果的可靠性，本研究采用最佳提取工藝條件重復試驗3次，結果顯示PGG提取率0.681 2%、0.680 1%、0.665 4%，平均提取率為0.675 5%。綜上所述，實際試驗結果和回歸模型的預測值基本吻合，表明回歸模型能夠準確的模擬和預測PGG提取率。

2.3 菱殼多酚對人源HER2腫瘤細胞株SK-BR-3 的細胞毒作用提取物A～E對人源HER2腫瘤細胞株SK-BR-3的抑制作用見圖3，結果顯示各提取物均能不同程度地抑制SK-BR-3腫瘤細胞株的增殖，抑制效果呈時間和濃度依賴性。與對照組相比，各提取物在25 μg/mL時抑制效果不明顯，50 μg/mL時提取物B、C、D表現顯著的抑制作用（P<0.05），隨著濃度的增加提取物A～E均表現出極顯著的抑制作用（P<0.01）。同時隨著處理時間的延長，各提取物對腫瘤細胞生長的抑制率提高（P<0.01）。因此菱殼多酚提取物對人源HER2腫瘤細胞SK-BR-3的增殖具有抑制作用。

3 結論與討論

響應面法優化提取工藝條件具有精密度高和效果預測準確等優點，是目前國內外研究中常用的方法。本研究在單因素試驗的基礎上，結合HPLC和響應面法確定了南湖菱殼中PGG的提取工藝，建立了相關性良好的擬合回歸方程。由方差分析可知模型的P=0.000 1<0.01，試驗所采用的二次模型顯著性較強，是有意義的模型。乙醇濃度、提取溫度的P值均小于0.05，對提取率的影響較為顯著，其中提取溫度對PGG的提取率影響最大，乙醇濃度次之，超聲時間有一定的影響。而交互項乙醇濃度和提取溫度（AB）對PGG提取率的影響達極顯著水平，乙醇濃度和超聲時間（AC）對PGG提取率的影響達顯著水平，提取溫度和超聲時間（BC）對PGG提取率的影響不顯著。最終確定最佳的提取工藝為料液比1 g ∶20 mL，乙醇濃度67%，提取溫度 80 ℃，超聲時間10 min，PGG提取率為 0.674 2%。菱殼提取物的細胞毒活性測定結果發現，在不同條件下制備得到的提取物對人源HER2陽性乳腺癌細胞增殖具有顯著的抑制作用，并且呈現一定的時間和濃度依賴性。在濃度為100 μg/mL時各部分提取物具有極顯著的抑制作用（P<0.01）。

植物多酚類成分對人類健康具有重要的意義，功能性食品和保健品越來越受到消費者的青睞，因此對功能性食品及其添加劑的研發也如火如荼。PGG是多酚類物質中具有很好市場應用前景的化合物[5]，其生物和化學合成、提取制備工藝、功能特性、穩定性和毒性等一直是研究的熱點。菱殼是菱角的廢棄物，從中獲取植物多酚和PGG具有很好的經濟效益和社會效益。HER2型乳腺癌在臨床上約占20%～30%，雖然比例不是最高，但由于HER2原癌基因的多拷貝的性質使得該型腫瘤有生存率低、惡性程度高、病情發展迅速、易復發（15%～24%）和臨床預后較差的特點，因此被稱為“最危險的乳腺癌”[17]。現階段治療HER2陽性乳腺癌最有效的是使用單克隆抗體聯合放化療，但單克隆抗體價格較昂貴，在我國大部分地區很難常規治療，而且許多患者還會發生復發、轉移、不良反應大、藥物耐藥性等諸多問題。植物提取物具有多靶點、整體性的作用特點，在腫瘤的預防和輔助治療方面也有較多的報道。因此研究開發菱殼多酚的提取制備工藝和抗腫瘤活性對于菱角資源的綜合開發利用具有重要的指導意義。

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