柔毛淫羊藿四川主產區種質資源的質量特征研究

★蔣勇 黃華 李仁清 徐艷琴 曾金祥（.江西中醫藥大學藥學院 南昌 330004；.江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心 南昌 330004）

藥用植物種質資源是中醫藥產業的源頭和人類健康需求的保障，也是中藥基礎研究及創新體系建設的物質基礎［1-2］，已成為國家重要的生物戰略性資源［3］。對于藥用植物，有效成分豐富的種質為選擇和利用的首選［3-5］。系統的質量評價可有效指導野生資源利用及人工種植種質和生境的選擇［6］。

淫羊藿為我國傳統中藥材，逐漸步入大宗品種行列，在中藥產業中占有重要地位，為最具開發潛力和重點研究的藥物之一［7-8］。優質與充足的淫羊藿資源是相關醫藥產品健康可持續發展的重要保障與支撐［9］。為保證藥品安全有效和穩定可控，藥材質量評價成為淫羊藿眾多研究方向中的重點和熱點［10-13］。開發淫羊藿，尤其是藥典收錄種的優異種質篩選成為迫在眉睫的問題。對保障資源供應，促進資源合理開發和利用具有重要意義。

柔毛淫羊藿（Epimedium pubescensMaxim.）歷來為藥典收錄種，是淫羊藿屬分布較廣的物種，盡管陜西省南部、甘肅省東南部和重慶市有少量分布，但主產區為四川省［14-16］。柔毛淫羊藿為淫羊藿藥材七大主流品種之一［17］，市場占有量達到39%［14］，其質量一直備受關注。但不同研究差異較大，樣本合格率從完全不達標0.0 %［18］到46.2 %［19］、52.2 %［20］、57.1 %［21］、66.7 %［12］、68.4 %［22］、83.3 %［23］和85.7 %［24］不等。分析其原因，由于不同研究所采用樣品來源不同［19-24］，或者為藥店購買的樣本［12,18］，采收期信息不詳，而不同采收期淫羊藿含量變化差異大［25］。因此，研究結果易出現時高時低情況，缺乏可比性。推薦淫羊藿質量評價研究選擇易判斷和易統一的采收期，即花期。此外，以往研究僅憑少數的樣本對淫羊藿含量檢測是不夠的全面的，因為淫羊藿物物種內會存在含量差異。綜合各方面因素考慮，既要保證有代表性，又要使樣本數量可操作范圍內，建議參考居群遺傳學的取樣策略［25］。

優異種質篩選和利用需以系統的質量評價為基礎。為剔除采收期對研究結果的影響，本研究所有樣本均采自花期。同時，為保證研究結果具有統計學意義，嚴格按照居群取樣策略，分析樣本覆蓋柔毛淫羊藿四川主產區。采用高效液相色譜法，測定其葉片中4種主要活性成分，進行系統質量評價和質量特征分析，為柔毛淫羊藿優異種質發掘、資源合理開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent Technologies Series 1260高效液相色譜儀、Chem Station工作站（Agilent 科技公司）；CP124S 型萬分之一電子天平（Sartoriu公司）；KQ-300DE超聲波清洗器（昆山市超聲有限公司）。

甲醇與乙腈（色譜純，美國ACS公司）；乙醇（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；對照品朝藿定A（批號120514）、朝藿定B（批號120518）、朝藿定C（批號120601）和淫羊藿苷（批號120423）購于四川省維克奇生物科技有限公司，質量分數均大于98 %。

1.2 實驗材料 柔毛淫羊藿分析樣本經江西中醫藥大學藥學院葛菲教授鑒定為E. pubescens Maxim.。于2015年和2017年花期采自四川省主產區的9個代表性產地（表1，圖1），每居群采集20～30個個體的成年葉片材料（但SCYA和SCYX居群由于居群過小或物候期影響，僅采集到9～11份合格樣本）。

表1 柔毛淫羊藿和采樣信息

圖1 柔毛淫羊藿采樣分布圖以及ABCI含量柱狀圖

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件和方法 色譜條件和方法參照本課題組已發表論文［10］，該色譜條件下的混合對照品及樣品色譜圖見圖2。

1.3.2 數據分析方法 各居群朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和淫羊藿多苷的平均含量及居群內個體間的標準差采用SPSS 21.0數據分析軟件進行統計。為考察主要生態因子對各成分積累的影響，各含量與經度、緯度和海拔高度的相關性分析使用SPSS 21.0皮爾森系數法進行雙側顯著性檢驗。并運用DPS 9.01軟件對4種含量與生態因子進行灰色關聯度分析。居群間差異使用MVSP 3.1軟件進行主成分分析（principal component analysis,PCA）和聚類分析（cluster analysis）［26］。

圖2 朝藿定A、B、C和淫羊藿苷混合對照品及柔毛淫羊藿9個居群的代表性HPLC圖

2 結果

2.1 淫羊藿多苷含量分布規律 從淫羊藿多苷含量在柔毛淫羊藿各居群中的分布來看，不同成分的含量普遍存在較大差異，一般以淫羊藿苷含量最為豐富，朝藿定C含量其次（表2）。其中，SCZX、SCDY、SCBC和SCYL這4個 居 群 淫 羊藿苷的含量遠較朝藿定C豐富，淫羊藿苷含量為朝藿定C含量的1.1（SCZX）～3.2（SCBC）倍。SCLY和SCYX居群淫羊藿苷較朝藿定C的含量稍高。但SCYA和SCDX居群為朝藿定C含量最豐富，其中，SCYA居群朝藿定C的含量為淫羊藿苷含量2.2倍，且其朝藿定C含量在所有居群中最高（2.93 %）。朝藿定A和朝藿定B這兩種成分，除SCTJ居群低于檢測限外，其余普遍存在，但其含量較朝藿定C和淫羊藿苷偏低，且各居群的含量差異較小（朝藿定A：0.14 %～0.47 %，朝藿定B：0.20 %～0.55 %）。

此外，SCYX居群由于淫羊藿苷和朝藿定C含量均偏低，使得4種成分含量相當（0.20 %～0.34 %），SCTJ居群則4種成分均低于檢測限（表2）。

2.2 居群間質量差異 以淫羊藿苷含量來看，依據2015版藥典淫羊藿苷不得低于0.5 %的質量標準［27］，除SCTJ和SCYX未達到標準，其余居群均達到藥典標準。其中，SCZX（2.21 %）、SCYL（1.57 %）、SCDY（1.33 %）和SCYA（1.31 %）居群淫羊藿苷含量較高，為藥典標準2.6～4.4倍，SCDX（0.72 %）、SCLY（0.61 %）和SCBC（0.55 %）居群稍高于藥典標準（表2）。

朝藿定C為柔毛淫羊藿中含量較突出的成分，除SCTJ居群外，其余居群均檢測到朝藿定C，且居群間含量差異非常懸殊，從0.17 %（SCBC）到2.93 %（SCYA），相差17倍。其中，SCYA（2.93 %）和SCZX（1.93 %）含量尤其突出，SCDX（1.2 %）和SCDY（0.97%）居群含量也相對較高，而SCYL（0.64 %）、SCLY（0.53 %）、SCYX（0.27 %）和SCBC（0.17 %）居群含量則相對偏低。

以淫羊藿多苷總量來看，除SCTJ居群外，其余居群含量均超過1.00 %，含量變異范圍為1.04 %（SCYX）～5.26 %（SCYA）。參照國家藥品標準修訂草案淫羊藿多苷高于1.5 %的標準［28］，除SCTJ（低于檢測限）、SCYX（1.04 %）和SCBC（1.06 %）居群外，其余居群均達到標準。其中，SCYA和SCZX居群淫羊藿多苷含量分別高達5.26 %和5.06 %，為草案標準的近3.4倍。SCDY（2.86 %）、SCYL（2.80 %）、SCDX（2.50 %）和SCLY（1.81 %）居群為標準的1.2～1.9倍（表2）。

表2 柔毛淫羊藿多苷的含量比較 %

從9個居群各成分的平均含量來看，淫羊藿苷和朝藿定C均為0.96 %，淫羊藿苷平均含量為藥典標準的1.9倍，淫羊藿多苷平均含量為2.50 %，為國家藥品標準修訂草案標準的1.7倍，表明柔毛淫羊藿整體質量優異。

整體來看，SCYA、SCZX和SCDY居群的朝藿定C、淫羊藿苷和淫羊藿多苷含量都在平均值以上，質量優異。SCYL居群淫羊藿和淫羊藿多苷含量均在平均值以上，且淫羊藿苷含量（1.57 %）僅次于最高的SCZX，居群整體質量也較為突出。SCDX居群淫羊藿苷（0.72 %）和淫羊藿多苷（2.50 %）含量均為中等，但朝藿定C（1.20 %）含量突出。SCLY居群淫羊藿苷（0.61 %）和淫羊藿多苷（1.81 %）含量均稍高于標準。SCBC居群淫羊藿苷（0.55 %）含量稍高于藥典標準，但淫羊藿多苷（1.06 %）含量低于標準。SCYX居群則淫羊藿苷（0.34 %）和淫羊藿多苷（1.04 %）含量均低于標準。SCTJ居群最為特殊，沒有檢測到任何一種成分。

2.3 PCA分析和聚類分析 PCA顯示第1主成分和第2主成分的貢獻率分別為84.89 %和14.55 %（圖3），其中第1主成分朝霍定C值最大（0.832），其次是淫羊藿苷（0.524）；第2主成分中淫羊藿苷為（0.845），說明柔毛淫羊藿以朝藿定C和淫羊藿苷含量為主成分。對不同居群綜合得分評價，發現SCYA和SCZX居群品質明顯優于其他居群，而SCDY、SCYL和SCDX居群得分大于0，擁有較高的朝藿定C和淫羊藿苷含量。SCTJ居群則得分最低（表3）。

表3 柔毛淫羊藿各個居群主成分值

將9個居群進行PCA主成分分析發現，各居群的分布說明居群間質量存在明顯差異。9個居群分為4 類（圖3）。SCYA居群為第1類，朝藿定C含量為居群間最高，淫羊藿苷含量也較高，但朝藿定C含量顯著高于淫羊藿苷。居群SCZX為第2類，朝藿定C含量非常突出，但淫羊藿苷含量更高，為居群間最高。居群SCYL、SCDY和SCDX為第3類，各成分含量及淫羊藿多苷含量均居中，其中SCYL和SCDY居群淫羊藿苷含量大于朝藿定C，而SCDX居群朝藿定C含量大于淫羊藿苷。居群SCBC、SCYX、SCLY和SCTJ為第4類，各成分含量及淫羊藿多苷含量均偏低，淫羊藿苷含量高于朝藿定C。其中，SCTJ居群因4種待測成分均未檢測到而得分最低。

圖3 基于朝藿定A、B、C和淫羊藿苷量的柔毛淫羊藿9居群PCA分析

聚類分析結果與PCA結果一致，將9個居群分為A、B、C和D四大類（圖4）。其中，A類居群淫羊藿多苷和淫羊藿苷含量普遍偏低，繼而分為A1和A2亞類。A1包括SCBC、SCYX和SCLY居群，整體淫羊藿苷含量偏低，A2包括SCTJ居群，未檢測到任何成分。B類居群淫羊藿苷與淫羊藿多苷含量中等，細分為B1和B2亞類。其中，B1包括SCDY和SCYL居群，淫羊藿多苷含量較高且淫羊藿苷含量高于朝藿定C含量，B2包括SCDX居群，淫羊藿多苷含量較高但朝藿定C含量高于淫羊藿苷含量。C類和D類淫羊藿多苷含量明顯高于其他7個居群。C類為SCYA居群，朝藿定C含量為居群間最高。D類為SCZX居群，淫羊藿苷含量為居群間最高。

圖4 柔毛淫羊藿基于ABCI含量的聚類分析圖

2.4 主要生態因子對含量的影響

2.4.1 相關性分析 柔毛淫羊藿9個居群的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量和ABCI總量與經度、緯度和海拔高度等主要生態因子的相關性分析結果表明，朝藿定A（r=-0.753,P=0.019）、朝藿定B（r=-0.794，P=0.011）、淫羊藿苷（r=-0.757，P=0.018）和ABCI總量（r=-0.762,P=0.017）與經度呈現顯著負相關。朝藿定A（r=-0.722，P=0.028）、朝藿定B（r=-0.796,P=0.010）、朝藿定C（r=-0.719，P=0.029）含量和ABCI總量（r=-0.692，P=0.039）與緯度也呈現顯著負相關。朝藿定C（r=-0.629，P=0.070）與經度，淫羊藿苷（r=-0.458，P=0.215）與緯度間缺乏顯著相關性。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量和ABCI總量與海拔高度不存在顯著相關性。

2.4.2 灰色關聯度分析 對柔毛淫羊藿不同居群主要活性成分與生態因子灰色關聯度分析結果表明，不同生態因子對4種活性成分以及ABCI的影響各不同（表4）。對朝霍定A、朝霍定B和朝霍定C含量影響程度均為東經＞北緯＞海拔。對淫羊藿多苷含量影響程度為北緯＞東經＞海拔。對淫羊藿苷含量影響程度為海拔＞東經＞北緯。

總體上來看，柔毛淫羊藿主成分含量與生態因子之間的灰色關聯系數（ri）為0.566 4～0.652 9，表明生態因子與主成分含量關系較為密切。朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊藿多苷對經緯度關聯性均高于海拔。而淫羊藿苷對于海拔關聯度高于經緯度。總體上來看，經度和緯度對于柔毛淫羊藿主要成分關聯程度大于海拔。

表4 柔毛淫羊藿主要活性成分與生態因子的灰色關聯度

基于以上生態因子對含量影響的分析結果，表明兩者間存在密切相關性。就淫羊藿苷及生態因子相關性而言，不同分析軟件結果存在一定差異。SPSS 21.0分析結果顯示，淫羊藿苷含量僅與經度存在顯著負相關性。而DPS9.01分析結果顯示，淫羊藿苷含量與海拔關系更密切。對比本研究SCYL和SCBC兩個經緯度相近的居群發現，高海拔SCYL居群的淫羊藿苷和朝藿定C含量分別為低海拔SCBC居群的2.9倍和3.8倍（表2）。說明剔除經度和緯度影響后，海拔因子對柔毛淫羊藿主要成分實際上存在影響。

3 討論

3.1 柔毛淫羊藿質量評述 通過本研究，四川主產區柔毛淫羊藿的質量具有以下特證和結論。

（1）柔毛淫羊藿四川主產區整體質量優異。77.8 %和66.7 %的居群其淫羊藿苷和淫羊藿多苷含量分別達到藥典標準和國家藥品標準修訂草案標準，與以往研究結果趨勢一致［21-24］。區別于藥典種箭葉淫羊藿（E. sagittatum (Sieb. et Zucc.)Maxim.）和巫山淫羊藿（E. wushanense T. S. Ying）大部分都達不到藥典標準［10,12］。

（2）本研究表明，柔毛淫羊藿6個居群以淫羊藿苷含量為最高，SCYA和SCDX居群以朝藿定C為主導。說明柔毛淫羊藿多數居群活性成分主要以淫羊藿苷為主導，與朝鮮淫羊藿（E. koreanum Nakai）類 似［12］，不同 于淫 羊藿（E. brevicornu Maxim.）以朝藿定B含量最豐富［6］，巫山淫羊藿［27］、箭葉淫羊藿［10］和粗毛淫羊藿（E. acuminatum Franch.）［29］普遍以朝藿定C含量最豐富。淫羊藿苷為淫羊藿藥材最重要的活性成分，但有報道表明，淫羊藿藥材經高溫加熱后，朝藿定C可轉化為淫羊藿苷［30］，暗示無論是淫羊藿苷主導，還是朝藿定C 主導，均為優異種質，但利用時需區別對待。

（3）本研究中，SCTJ居群最為特殊，所有個體均未檢測到任何一種成分。本研究多次核查實驗材料，確定實驗材料無誤，且對SCTJ居群30個個體樣本進行了多次重復檢測，結果均未發現有含量個體。可排除實驗材料和操作誤差。SCTJ居群位于四川省與陜西省交界處，為其物種分布邊緣，可能是由于地理環境因素導致，其特殊性有待進一步研究。

3.2 生境的討論 經度、緯度和海拔是影響藥用植物分布及生長發育的重要環境因子［5,31］。研究這些因子與藥用植物中有效成分含量的相關性，不僅有利于探索藥材質量形成規律，而且，可為藥用植物的栽培和規范化種植提供理論依據。

本研究表明，柔毛淫羊藿四川主產區的居群，除朝藿定C與經度，淫羊藿苷與緯度缺乏顯著相關性外，其余含量與經度和緯度均呈顯著負相關。未來研究可以考慮進一步開展氣候、溫度和水分等因素對柔毛淫羊藿活性成分積累影響的研究。

此外，本研究各成分含量與海拔高度均不存在顯著相關性，似乎說明海拔高度對質量缺乏影響。但事實是否如此？本研究發現，SCBC和SCYL居群的地理位置相鄰，其經度和緯度極為接近，但SCYL居群的海拔高度（1 377 m）遠高于SCBC居群（877 m）。質量檢測結果表明，SCYL居群的含有目標成分均遠高于SCBC居群（表2）。提示海拔高度對柔毛淫羊藿成分的積累可能也具有重要影響。因此，關于海拔對藥效成分積累的影響還需要在同一地區不同海拔的多個居群開展研究，即剔除經度和緯度的影響，才能獲到較可靠的結論。

3.3 對種質利用的啟示 從淫羊藿苷和淫羊藿多苷的含量來看，位于四川省西南部或中部的居群質量均較理想，尤其以西南部的SCYA和SCZX居群最為優異。這與付亮等雅安市上里鎮和都江堰市產柔毛淫羊藿質量較優的結果吻合［32］。這些種質應是開發利用的重點，可作為藥材規范化栽培優異的候選種質，其生境也可為栽培基地的選擇提供參考。SCTJ居群雖不宜作為藥用種質。但其特殊性對開展次生代謝產物積累和淫羊藿藥材質量形成機制研究或許是非常理想的對照材料。