商洛南五味子醇甲提取及復合保鮮液應用研究

劉庚玫，張曉虎，張峻偉

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

0 引言

南五味子為五味子科(Schisandraceae)南五味子屬(KadsuraKaempf.exJuss.)南五味子(KadsuralongipedunculataFinetetGagnep.)植物的果實。現代科學研究表明南五味子中含有機酸、木脂素、倍半萜及多糖等多種成分，其中南五味子醇甲、南五味子甲素、南五味子酯甲等木脂素類化合物為其主要活性成分,具有抗氧化、抗炎抗菌、舒張血管、保肝強脾等藥理作用[1～6]。

南五味子提取物可誘導果蔬本身防御性酶活力的增強，提高抗病性，有效減緩果蔬采后腐壞，具有食品防腐及果蔬保鮮的良好應用前景[7,8]。馬永全等[9]測定五味子提取物的抑菌活性及清除1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH)、羥自由基(OH)、超氧陰離子(O2-)的能力，研究表明五味子提取物具有明顯的抑菌及抗氧化作用。李洪洋[10]對五味子醇甲的抑菌性進行研究，結果表明五味子醇甲對大腸桿菌、黑曲霉、啤酒酵母具有顯著的抑菌活性。林雄平等[11]對南五味子根黃酮提取物的抗菌抗氧化活性進行研究，結果表明對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、啤酒酵母均有一定程度的抑菌效果。

研究選取商洛南五味子作為對象，采用微波輔助乙醇浸提法提取南五味子醇甲，以其為指標采用響應面法通過高效液相色譜法對南五味子醇甲的提取工藝進行優化。研究南五味子醇甲對三種常見菌抑菌效果，并將南五味子醇甲與普魯蘭多糖、丙三醇、油酸進行復配，將配制的復合防腐保鮮液用于雞蛋保鮮，為南五味子醇甲應用于蛋類保鮮的研究提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 材料：南五味子干燥果實(購于商洛市商州區福鑫康藥業)、當日產新鮮雞蛋(購于商州區沙河子鎮養雞場)、一次性泡沫包裝盒(購于商州區家佳惠超市)。

試劑：五味子醇甲標品(分析純，購于江蘇永健醫藥科技有限公司)，無水乙醇(分析純)，瓊脂，95%乙醇(分析純)，甲醇(分析純)，蒸餾水，胰蛋白胨，普魯蘭多糖，丙三醇，油酸，磷酸(分析純)。

菌種：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌(購自西安市長安區瑞昇化玻儀器供應站)。

1.1.2 主要儀器 JP-500C型高速多功能粉碎機，永康市久品工貿有限公司；DHG9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀器，日本島津有限公司；LRH-70F型生化培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；pHS-25型數顯pH測試儀，上海始恒儀器有限公司。

色譜條件：色譜柱：ODS-3(C18)(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以甲醇-0.05%磷酸溶液(60∶40)為流動相；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長為 250 nm[12]；柱溫：30℃；進樣量：10 μL[13]。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗材料預處理 將南五味子干燥果實放入高速萬能粉碎機粉碎，過60目篩，置于干燥的廣口瓶中，密封備用。

1.2.2 標準曲線的制備 稱取5mg五味子醇甲標準品，加入甲醇溶解搖勻并定容于10 mL潔凈容量瓶中，取上述溶液2、4、6、8、10 mL分別置于潔凈試管中，各個試管用甲醇定容至10 mL。加甲醇稀釋至10 mL刻度線，按1.1.1色譜條件，分別重復進樣3次，測定并記錄峰面積。制備標準曲線見圖1，回歸方程為：y=7E+06x+71418，R2=0.9983。

1.2.3 南五味子醇甲的提取 準確稱取5 g南五味子粉末，放入100 mL燒杯中，加入一定濃度和比例的乙醇，浸泡5 min，攪拌均勻，然后置于微波爐提取一定時間，將提取液倒入100 mL容量瓶，用蒸餾水定容，待測[14]。

1.2.4 南五味子醇甲的測定 使用移液槍將不同濃度的南五味子醇甲提取液吸取1.0 mL，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，按1.1.1色譜條件重復進樣三次，按下式計算提取液中南五味子醇甲的質量濃度[15]。

Y(mg·g-1)=C·N·V/M

式中：C-為回歸方程計算出的南五味子醇甲濃度(mg·mL-1)；N-為溶液稀釋倍數；V-為提取液體積(mL)；M-為南五味子醇甲粉末質量(g)。

1.2.5 單因素試驗 分別考察液料比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12)、微波功率(200、350、500、650、800W)、乙醇體積分數(55、65、75、85、95%)、提取時間(5、10、15、20、25 min)對南五味子醇甲得率的影響。

1.2.6 響應面法試驗 基于單因素試驗，進行響應面法優化。以X1、X2、X3為自變量，以南五味子醇甲得率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6.0軟件對乙醇體積分數、微波功率和提取時間3個因素進行3水平響應面設計試驗，得到最佳優化提取工藝參數，并進行驗證實驗測評最佳提取工藝參數可靠性。

1.2.7 抑菌性試驗 菌懸液的制備：在試管中注入等量無菌水，挑取活化后的菌種接入到無菌水中，震蕩，搖勻，制備成濃度為1×105cfu·mL-1的菌懸液備用。

南五味子醇甲抑菌能力測定：南五味子醇甲提取液配制成7個濃度梯度(2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg·mL-1)，每個濃度3組平行。在37℃、相對濕度67%的條件下培養24 h后取出觀察，用十字交叉法測量抑菌圈直徑[16]。

1.2.8 復合保鮮液配方制備 單因素試驗：分別考察普魯蘭多糖添加量(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 g)、丙三醇添加量(0.5、1.0、1.5、2、2.5 mL)、油酸添加量(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL)、南五味子醇甲添加量(6、7、8、9、10 mL)對雞蛋保鮮效果的影響。

正交試驗：在單因素試驗的基礎上，選取普魯蘭多糖、丙三醇、油酸、南五味子醇甲添加量4個因素、設置3個水平，采用L9(34)正交實驗，優化復合保鮮液配方[17,18]。

1.2.9 復合保鮮液應用 將制備的復合保鮮液用于雞蛋保鮮，取未處理過的新鮮雞蛋作為對照組按照相同實驗條件在35℃恒溫加速貯藏，檢測失重率、哈夫單位、蛋白pH及感官品質。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 乙醇體積分數對南五味子醇甲得率的影響 據圖2分析可知，南五味子醇甲的提取率隨著乙醇體積分數的不斷增大先提高而后逐漸降低，乙醇體積分數達到85%后提取率呈下降趨勢，究其原因：一是由于溶液極性變強，使木脂素類物質溶解度降低。二是較高的乙醇濃度會分解或破壞南五味子中的有效成分使醇甲含量變低。因此，選取85%為較佳乙醇體積分數。

2.1.2 料液比對南五味子醇甲得率的影響 據圖3分析可知，南五味子醇甲得率隨著料液比得增加而變大，當料液比為1∶10時得率為2.351 mg·g-1達到此范圍最大值；當料液比增加到1∶12時，得率無明顯改變。考慮經濟效益可選取1∶10作為較佳料液比。

2.1.3 微波功率對南五味子醇甲得率的影響 據圖4分析可知，微波功率從350 W增加到500 W時，南五味子醇甲的得率不斷增加，當微波功率達到500 W時得率最達。隨著微波功率逐漸增大，南五味子內部結構被破壞，導致醇甲得率降低。因此，選取500 W為較佳微波功率。

2.1.4 提取時間對南五味子醇甲得率的影響 據圖5分析可知，南五味子醇甲的提取率隨著提取時間的不斷延長，先增大而后緩慢減小。提取時間達到10 min時醇甲得率達到最大，繼續延長時間使細胞與空氣接觸時間延長同時增加接觸面積，其內部發生降解或縮合反應使得率降低。因此，10 min為較佳提取時間。

圖2 乙醇體積分數對南五味子醇甲得率的影響

圖3 料液比對南五味子醇甲得率的影響

圖4 微波功率對南五味子醇甲得率的影響

圖5 提取時間對南五味子醇甲得率的影響

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面實驗方案與結果 以單因素實驗的結果為基礎，在固定料液比為1:10的前提下，選擇A(乙醇體積分數)、B(微波功率)、C(提取時間)為響應面自變量，設計3因素3水平的響應面試驗方案與結果見表1。

2.2.2 回歸分析 利用Design-Expert 8.0.6.0對響應面實驗結果數據進行分析，得到以編碼因子表示的最終方程為：

Y=2.78+0.32A+0.037B+0.16C+0.06AB-0.30AC+0.062BC-0.74A2-0.038B2-0.22C2

表1 響應面試驗設計與結果

由表2，該實驗所建立的二次多項模型，P模型<0.0001，具有高度顯著性。P失擬項=0.031，不顯著，表明無失擬因素存在。其中交互項(AC)差異高度顯著，乙醇體積分數(A)差異極顯著，提取時間(C)差異高度顯著。

表2 回歸模型系數的顯著性檢驗結果

由表3，南五味子酯甲提取率的變異系數C.V.%可以反應回歸方程可信度。校正系數R2Adj=0.9762，表明該回歸模型擬合程度好，可以解釋97.62%響應值的變化，變異系數C.V=3.36%，說明所得數據具有較高的穩定性。

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應面分析 由圖6，乙醇體積分數固定時，南五味子醇甲得率隨微波功率的逐漸增加先升高后降低，微波功率在500 W時得率最大；微波功率固定時，醇甲得率隨著乙醇體積分數的增加先升高后降低，乙醇體積分數在85%～90 %時南五味子醇甲得率最大；由圖7，乙醇體積分數固定時，南五味子醇甲得率隨提取時間的增加而變大，提取時間為9～11min時醇甲得率最大；提取時間固定時，得率隨乙醇體積分數的逐漸增加先升高后降低，乙醇體積分數在85%時南五味子醇甲得率最大；由圖8，微波功率固定，南五味子醇甲得率隨著提取時間的延長而緩慢增加，提取時間為9～11 min時醇甲得率達到最大，隨后得率趨于穩定變化較小；提取時間固定時，醇甲得率隨微波功率的逐漸增加呈現先增長再下降的細微變化，微波功率在500 W時南五味子醇甲得率最大。

圖6 乙醇體積分數和微波功率對南五味子醇甲得率的交互影響等高線和響應曲面

圖7 乙醇體積分數和提取時間對南五味子醇甲得率的交互影響等高線和響應曲面

圖8 微波功率和提取時間對南五味子醇甲得率的交互影響等高線和響應曲面

2.2.4 驗證試驗 優化工藝條件：料液比1∶10，微波功率為500 W，乙醇體積分數為85%，提取時間為10 min。由響應面試驗結果及Box-Benhnken設計給出的最優方案進行南五味子醇甲的提取，檢測后發現南五味子醇甲得率為2.824 mg·g-1，優于單因素實驗結果可作為優化方案。

2.3 抑菌性實驗結果分析

表4表明，南五味子醇甲的抑菌效果順序為：沙門氏菌<金黃色葡萄球菌<大腸桿菌，大腸桿菌的MIC為0.125 mg·mL-1，對其抑菌效果明顯優于金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

表4 南五味子醇甲最低抑菌濃度

2.4 復合保鮮液配方制備及應用

2.4.1 單因素實驗結果與分析 普魯蘭多糖含量對雞蛋保鮮效果的影響：由圖9，隨著貯藏時間延長，各組雞蛋均有一定失重，在普魯蘭多糖添加量為6 g時其失重率減輕最緩；由圖10，各試驗組哈夫單位隨時間的延長而減小，其中普魯蘭多糖添加量為6 g和5.5 g時雞蛋哈夫單位值變化較小，與對照實驗組相比保鮮效果較為明顯；由圖11，各試驗組蛋黃指數隨時間的延長而減小，空白組下降速度最快，在普魯蘭多糖添加量6 g時蛋黃指數下降較緩，結合以上分析可得普魯蘭多糖添加量為6 g時復合保鮮液保鮮效果較好。

丙三醇含量對雞蛋保鮮效果的影響：由圖12，隨著貯藏時間延長，雞蛋均有一定的失重，其中丙三醇添加量為2.5 mL時雞蛋重量減輕較緩，比對照實驗組低了3.9%；由圖13，計算哈夫單位后發現丙三醇添加量為2.5 mL時雞蛋哈夫單位值變化較小，在同組實驗中較高；由圖14，丙三醇添加量為2.5 mL和2 mL時蛋黃指數下降稍緩，結合以上分析可得丙三醇添加量為2.5 mL的復合保鮮液保鮮效果較好。

油酸含量對雞蛋保鮮效果的影響：由圖15，隨著貯藏時間延長，雞蛋均有一定的失重，其中油酸添加量為3 mL時雞蛋重量減輕較緩，比對照實驗組低了3.2%；由圖16，計算哈夫單位后發現油酸添加量為3 mL時哈夫單位值變化較小，在同組實驗中較高，為53 Ha。可能由于添加較高的油酸黏度及穩定性較好，能更好的成膜保護雞蛋；由圖17，油酸添加量為3 mL和3.5 mL時蛋黃指數下降較緩，結合實驗數據可得油酸添加量為3 mL時保鮮效果較好。

南五味子醇甲提取液對雞蛋保鮮效果的影響：由圖18，貯藏時間延長使雞蛋均有一定的失重，使用10 mL五味子醇甲溶液的雞蛋重量減輕較緩，比對照實驗組低了3.1%；由圖19，計算哈夫單位后發現南五味子醇甲添加量為10 mL時其雞蛋哈夫單位值變化較小，經15 d 35℃恒溫保藏后為52 Ha，與對照試驗組相比保鮮效果明顯；由圖20，各試驗組蛋黃指數隨時間的延長而減小，空白組下降速度最快，在南五味子醇甲添加量分別為9 mL與10 mL時蛋黃指數下降較緩，結合實驗數據可得南五味子醇甲添加量為10 mL時保鮮效果較好。

圖9 普魯蘭多糖添加量對雞蛋失重率的影響

圖10 普魯蘭多糖添加量對哈夫單位的影響

圖11 普魯蘭多糖添加量對蛋黃指數的影響

圖12 丙三醇添加量對雞蛋失重率的影響

圖13 丙三醇添加量對哈夫單位的影響

圖14 丙三醇添加量對蛋黃指數的影響

圖15 油酸添加量對雞蛋失重率的影響

圖16 油酸添加量對雞蛋哈夫單位的影響

圖17 油酸添加量對蛋黃指數的影響

圖18 南五味子醇甲添加量對雞蛋失重率的影響

圖19 南五味子醇甲添加量對雞蛋哈夫單位的影響

圖20 南五味子醇甲添加量對蛋黃指數的影響

2.4.2 正交試驗結果與分析 由表5，在35℃恒溫貯藏條件下，不同配方復合保鮮液處理的雞蛋與空白組相比失重率均為上升趨勢，哈夫單位值呈下降趨勢。結果表明，經10 mL五味子醇甲溶液+5.5 g普魯蘭多糖+1.5 mL丙三醇+3.5 mL油酸處理過的雞蛋保藏效果較好。

2.4.3 復合保鮮液應用 通過以上正交試驗選擇出最佳的復合保鮮液配方為A3B2C1D3，將制備的復合保鮮液應用于雞蛋，取未處理過的新鮮雞蛋作為對照組按照相同實驗條件在35℃恒溫加速貯藏5 d，檢測貯藏后雞蛋的失重率、哈夫單位及感官品質見表6。

表5 正交試驗方案及結果與分析

表6 35℃加速貯藏后雞蛋感官評定結果

3 結論與討論

3.1 結論

(1)基于單因素進行響應面試驗的方法得到商洛南五味子醇甲的優化提取工藝為：料液比1∶10的條件下，微波功率500 W、85%的乙醇體積分數提取10 min，南五味子醇甲的得率為2.824 mg·g-1。

(2)南五味子醇甲的抑菌效果順序為：沙門氏菌<金黃色葡萄球菌<大腸桿菌；其對大腸桿菌的抑菌效果最為顯著，MIC為0.125 mg·mL-1。

(3)制備的復合保鮮液最優配方為：10 mL南五味子醇甲溶液、5.5 g普魯蘭多糖、1.5 mL丙三醇、3.5 mL油酸，將其應用于新鮮雞蛋后，35℃恒溫貯藏，與空白對照實驗組對比，使用復合保鮮液后的雞蛋保藏效果要優于空白對照組，能延長貯藏期15 d。

3.2 討論

(1)研究通過微波輔助乙醇浸提法提取木脂素類物質南五味子醇甲，利用高效液相色譜儀測定其得率，得到南五味子醇甲的優化提取工藝，與其他提取方法如乙醇回流、超臨界萃取法相比操作簡便、省時省力，適用于大批量的提取，可明顯節約成本。提取的南五味子醇甲略低于黃惠華的試驗得率[19]，究其原因：一是由于購買的干制南五味子在采摘時錯過了南五味子醇甲含量最高的時期，導致部分南五味子醇甲分解；二是由于粉碎程度不夠細小，未能將有效成分全部提取。試驗的抑菌效果順序與吳少輝的研究結論一致[7]。

(2)研究能夠較好地提取并檢測南五味子醇甲，探討了一條較為精準、可操作的實驗方法。南五味子醇甲具有一定的清除自由基、保鮮防腐效果，利用南五味子醇甲與普魯蘭多糖、丙三醇、油酸進行復配并應用于蛋類保鮮中，可為蛋類制品的貯藏及運輸銷售的防腐保鮮提供一定的參考依據。

(3)建議今后研究注意：盡量在南五味子花期結束后就進行采摘，最大程度避免因采摘期不當造成的得率偏差；可進行多次粉碎以盡可能增大與溶劑的接觸面積提高提取率；鑒于南五味子果核與果肉中的醇甲含量差別較大，今后可分別進行研究。