Quaterrylene-環糊精腫瘤光熱治療劑的大鼠腎-尿代謝研究

李金梅，羅亞麗，王克讓

(1. 保定市第一中心醫院 病理科，河北 保定 071000；2. 河北大學 化學與環境科學學院，藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，河北 保定 071002)

惡性腫瘤嚴重威脅著人們健康. 根據最新統計結果，全球每年新增腫瘤患者約1 810萬人，每年約960萬人死于惡性腫瘤，而中國新增患者約380.4萬，死亡患者約229.6萬[1]. 光熱治療(photothermal therapy, PTT)是將光能轉化為熱能而達到治療效果的一種新的治療手段，具有組織穿透性深、靈敏度高、全身毒性低、精確可控性高,以及無創性或微創性等優點，在癌癥治療方面具有重要應用[2]. 目前，廣泛研究的光熱治療劑主要包括：無機納米材料[2]、碳納米材料[3]、有機聚合物[4]和有機小分子[5]等. 每種光熱治療劑都有其自身固有的特殊理化性質，具有各自的優點和局限性.

根據美國食品和藥品管理局(FDA)規定所有注射藥物分子應在一定的時間從體內完全清除[7]. 腫瘤光熱治療劑作為診療一體化分子，代謝問題是限制其臨床應用研究的關鍵科學問題之一. 藥物代謝的主要途徑是肝脾代謝和腎代謝. 藥物的腎-尿代謝與肝脾代謝相比，具有代謝時間短、對機體其他器官損傷小和潛在的長期毒副作用低等優點[8]. 因此，發展腎-尿代謝型光熱治療劑在腫瘤光熱治療方面具有重要意義.

最近，筆者設計合成了環糊精修飾的quaterrylene衍生物(QDI-CD，圖1)，其在體外和體內具有良好的光熱治療作用，光熱轉化效率達62.53%. 另外，代謝研究發現QDI-CD在昆明鼠體內的腎-尿代謝率可達(67.00±2.37)%，并且治療組和空白組的腎臟病理顯示其對腎臟沒有損傷(圖1)[9]. 與昆明鼠相比，SD大鼠的體質量約為200 g，是昆明鼠體質量(50 g)的4倍. 另外，腹腔注射和尾靜脈注射是藥物研究主要的給藥方式，SD大鼠體質量大，更有利于研究腹腔注射給藥對藥物代謝的影響[10-11]. 因此，筆者研究了QDI-CD在SD大鼠體內的代謝情況，發現QDI-CD具有好的腎-尿代謝率，并且代謝前后QDI-CD的結構沒有改變.

圖1 環糊精修飾quaterrylene衍生物QDI-CD的結構(a)，以及光熱治療(b)和空白組(c)的腎臟病理圖[9]Fig.1 Structure of cyclodextrin modified quaterrylene derivative (QDI-CD)(a), Hematoxylin and eosin (H&E)-stained histological sections of kidney obtained from mice in the PTT group (b) and control group (c)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高分辨質譜儀：FT-MALDI MS (布魯克公司)；紫外-可見分光光度計：Cary 5000 (安捷倫科技有限公司)；小鼠代謝籠；常用有機溶劑為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠尿液收集

4只SD大鼠，體質量為200 g/只，隨機分為4組，放在代謝籠中，分為實驗組1、實驗組2、實驗組3和空白組. 代謝實驗前，SD大鼠禁食12 h. 將1 mL質量濃度為1 mg/mL的QDI-CD光熱治療劑腹腔注射到SD大鼠體內，空白組腹腔注射1 mL的PBS緩沖溶液，在代謝籠內分別收集SD大鼠12 h和24 h的尿液.

1.2.2 SD大鼠尿液處理及測試

將收集的SD大鼠不同代謝時間的尿液用去離子水稀釋到合適質量濃度，尿液12 000 r/min離心5 min，取上層清液，在紫外-可見分光光度計上測試其紫外吸收特征.

1.2.3 尿液的高分辨質譜分析

將收集的SD大鼠的尿液用二氯甲烷萃取3次，將二氯甲烷相合并，濃縮，通過硅膠柱層析分離純化，洗脫劑為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1. 分離純化后的尿液代謝物經高分辨質譜分析.

2 結果與討論

2.1 SD大鼠尿液的紫外-可見光譜分析及代謝率

按1.2.1小節操作收集尿樣.如表1所示，腹腔注射12 h后，實驗組1～3收集的尿液分別為9.9、6.1和5.1 mL. 腹腔注射24 h后，實驗組1～3收集的尿液分別為6.2、7.3、6.8 mL. 基于QDI-CD分子在600～1 000 nm內具有紫外-可見特征吸收峰，而尿液中的代謝物在這一吸收區間沒有干擾，因此，通過紫外-可見分光光度計測試了代謝尿液的紫外-可見吸收峰.

表1 實驗組SD大鼠在12 h和24 h的尿液體積

由于SD大鼠的代謝尿液量不同，導致QDI-CD含量不同，實驗組2和實驗組3的QDI-CD的特征吸收峰超出紫外-可見分光光度計的測試量程，因此，將實驗組2和實驗組3的12 h和24 h代謝尿液用去離子水分別稀釋5倍到30.5 mL/36.5 mL和25.5 mL/34.0 mL. 如圖2實驗組1-3在600～1 000 nm內有QDI-CD的特征吸收峰，最大吸收峰處的吸光強度分別為0.551 659、0.190 959、0.328 329. 根據朗伯比爾定律，經折算尿液中QDI-CD的質量分別為0.406 2、0.433 2、0.622 8 mg. 因此，QDI-CD光熱治療劑在每組SD大鼠的腎-尿代謝率分別為40.62%、43.32%、62.28%. 3組實驗組的QDI-CD光熱治療劑的平均腎-尿率達到48.74%. 研究結果表明，無論是體質量為50 g的昆明鼠，還是體質量達到200 g的SD大鼠，QDI-CD都有較高的腎-尿代謝率. 另外，QDI-CD腹腔注射24 h后，SD大鼠的代謝尿液中沒有QDI-CD的特征吸收峰，說明腹腔注射12 h后，QDI-CD已基本代謝完全. 這些研究結果說明QDI-CD在SD大鼠體內能快速代謝.

圖2 腹腔注射12 h后，QDI-CD(1 mL, 1 mg/mL)的腎-尿代謝的尿液的紫外-可見吸收光譜(a)，藥物注射12 h和24 h后，不同實驗組的平均腎-尿代謝率(b)Fig.2 UV-Vis spectra of urines for the SD rats after injection of PBS and QDI-CD group 1, QDI-CD group 2 and QDI-CD group 3 at 12 h (a), and the renal clearance efficiencies at 12 and 24 h, respectively(b)

2.2 QDI-CD代謝后的高分辨質譜

代謝前后藥物分子結構的穩定性是評價藥物臨床應用的重要指標之一. 鑒于QDI-CD具有好的腫瘤光熱治療效果[9]和好的腎-尿代謝過程，進一步研究了QDI-CD在大鼠體內代謝前后的結構穩定性. 腹腔注射1 mL的QDI-CD(1 mg/mL)，收集SD大鼠12 h內的尿液. 由于尿液中的成分比較復雜，為了提高高分辨質譜測試的準確度，將SD大鼠的尿液做了分離. 由于環糊精分子的修飾，QDI-CD既能溶于水溶液，又能溶于常見的有機溶劑. 因此，用二氯甲烷萃取尿液，進而經柱層析分離純化，再進行質譜分析. QDI-CD的結構式為C168H234N2O72，理論相對分子質量為3 432.474 4. 如圖3所示，SD大鼠尿液的高分辨質譜為3 455.478 4，分析QDI-CD的結構特征，3 455.478 4的質譜峰為QDI-CD的[M+Na]+. QDI-CD的[M+Na]+的分子式為C168H234N2NaO72，相對分子質量為3 455.464 2，高分辨質譜圖(圖3)顯示3 455.478 4. 研究結果說明QDI-CD腎-尿代謝前后分子結構沒有改變，QDI-CD具有非常好的結構穩定性.

圖3 QDI-CD腹腔注射12 h后，SD大鼠尿液的高分辨質譜(MALDI-TOF)Fig.3 MALDI-TOF spectrum of QDI-CD in urine samples from SD rats after 12 h of intraperitoneal injection

3 結論

研究了環糊精修飾quaterrylene衍生物QDI-CD在SD大鼠中的腎-尿代謝情況，發現腹腔注射1 mL的QDI-CD(1 mg/mL)12 h后，QDI-CD可代謝完全，平均腎-尿代謝率達到48.74%. 另外，通過高分辨質譜研究了SD大鼠代謝尿液中QDI-CD的結構特征，結果顯示QDI-CD代謝前后分子結構沒有發生改變，說明其具有良好的結構穩定性. 分析QDI-CD的結構特征可知，quaterrylene作為近紅外吸收分子具有良好的結構穩定性[12]，全甲基化環糊精分子中羥基被甲氧基取代，不僅增強了水溶性，而且增強了結構穩定性[13]. 此外，環糊精類衍生物不僅具有良好的水溶性，而且作為腎-尿代謝促進分子廣泛用于腎功能研究[14]. QDI-CD分子作為腎-尿代謝型有機光熱治療劑在腫瘤治療方面具有潛在的應用價值.