注射用異煙肼-鏈霉素原位凝膠制備研究

張 妍 鄭銘鋒 蔡鑫君 金 潔

骨結核為結核桿菌入侵骨組織而生成的一種慢性疾病，可導致關節損傷、骨損傷，并且會造成全身影響[1]，臨床常用異煙肼、利福平、鏈霉素治療。溫敏型原位凝膠即在低室溫下是流動的液體，到達目標位點后隨溫度升高快速進行相轉變，形成半固體凝膠，并能較長時間地黏附于用藥部位，緩慢釋放藥物，實現靶向給藥，從而提高藥物的生物利用度，延長藥物作用的時間[2]。本實驗擬將異煙肼、鏈霉素聯合制備成溫敏型原位凝膠用于局部抗結核注射給藥，以減少兩者的藥量，延長藥物在用藥部位的停留時間，使用藥部位的藥物濃度顯著升高，降低不良反應，減少藥物刺激性，從而增加臨床療效[3]。

1 儀器與藥品

1.1 儀器 S220K 臺式PH 計（梅特勒-托利多儀器有限公司），SWBR17 水浴恒溫振蕩器（美國Shellab 公司），85-2 恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠），PL602E 電子秤（梅特勒-托利多儀器有限公司），NDJ-1 型超聲波黏度計（上海精密天平儀器廠），Milli-Q A10 純水儀（Merck Millipore），ME104E萬分之一天平（梅勒特-托利多儀器有限公司）。

1.2 實驗藥品 泊洛沙姆188（P188，上海昌為醫藥輔料技術有限公司，批號WPMI556B）、泊洛沙姆407（P407，上海昌為醫藥輔料技術有限公司，批號WPDI608B），羥丙基甲基纖維素（HPMC，南京業績醫藥有限公司，批號5115830），異煙肼原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號R21A6TI）、鏈霉素硫酸鹽原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號S09M8Y307），磷酸二氫鈉（上海展云化工有限公司，批號170220），磷酸氫二鈉（上海展云化工有限公司，批號180401），純化水。

2 方法與結果

2.1 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠制備 精密稱取處方量的異煙肼原料藥和鏈霉素硫酸鹽于2 個25mL燒杯中，各加入12.5mL 純化水，攪拌使其溶解。然后將其倒入2 個預先加入0.60g P188、3.50g P407 以及0.0375g HPMC 的西林瓶（25mL）中。讓混合物在4℃環境下自然溶脹，儲存過夜除氣泡，形成透明溶液后將其混合，得到載異煙肼-鏈霉素的原位凝膠。

2.2 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠的膠凝化溫度測定按“2.1”制備3 份載異煙肼-鏈霉素原位凝膠溶液，采用倒置法[4]，測定載異煙肼-鏈霉素原位凝膠的膠凝溫度。將溶液置于水浴下慢慢加熱，測定凝膠溫度，升溫速度每分鐘1℃，每升高1℃，取出西林瓶，倒置觀察是否形成凝膠，直到瓶中的溶液倒置無流動，記錄溫度，每個樣品測3 次，取平均值。

2.3 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠黏度測定 按“2.1”制備3 份載異煙肼-鏈霉素原位凝膠溶液，使用超聲波黏度計，采用3 號轉子，轉速為60rpm/min，黏度范圍：20～20000mPa.s，將溶液放進待測樣品瓶中（保持溶液的液面沒至轉子的液面刻度線），測定25℃時的黏度。每個樣品測3 次，取平均值。

2.4 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠穩定性考察 按“2.1”制備2 份載異煙肼-鏈霉素原位凝膠溶液，分別于25℃和35℃條件下靜置15min，然后以2000r/min離心15min，觀察是否有分層等不穩定現象。

2.5 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠體外溶蝕時間考察采用無膜溶出法測定載異煙肼-鏈霉素原位凝膠的體外溶蝕時間。先稱空瓶（10mL 西林瓶）重，加入原位凝膠約5g，置于（37.0±0.1）℃的水浴恒溫振蕩器中平衡10min，使聚合物溶液完全形成凝膠。取出凝膠，加入37℃1mL 的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4）作為釋放介質，再放入水浴恒溫振蕩器中，在（37.0±0.1）℃下，以30r/min 的速率振蕩，在設定的時間內傾出全部釋放介質，將瓶擦干后稱重。然后重新放入水浴恒溫振蕩器中平衡10min，再補充1mL 37℃的PBS 溶液。按此步驟反復，直到剩余凝膠量小于起始量的10%。每個實驗設置3 個平行組，記錄溶蝕時間，取其平均值。

3 結果

3.1 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠處方優化 參照文獻[5]，在單因素實驗考察的基礎上，選取P407、P188以及HPMC 在凝膠中所占比例3 個因素作為考察因素，每個因素設置3 個水平，因素水平表（見表1）。設計正交實驗來確定載異煙肼-鏈霉素原位凝膠的基質比例，以膠凝溫度、凝膠黏度、溶蝕時間作為評價指標來選擇適宜處方。根據預實驗，優先考慮溶蝕時間，采用溶蝕最優處方為4.8% P188、28.0% P407、0.3% HPMC。

表1 因素水平表（%）

3.2 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠外觀 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠室溫時外觀呈現白色透明液體態，達到膠凝溫度后外觀為白色透明凝膠態。

3.3 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠的膠凝化溫度 所制得的3 份樣品的膠凝溫度分別為30.50、30.00、30.50，平均值30.33。結果表明，該凝膠相變溫度適宜，符合在室溫下為流動的液體，在體溫下發生相變形成凝膠的要求。

3.4 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠黏度 3 份樣品的凝膠黏度分別為540、530、550，平均值為540。表明載異煙肼-鏈霉素原位凝膠在室溫下黏度較小，有很好的流動性；在體溫下黏度較大。

3.5 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠穩定性 異煙肼-鏈霉素凝膠溶液在25℃和35℃膠凝后經離心不發生分層渾濁等現象，表示該制劑有良好的穩定性。

3.6 載異煙肼-鏈霉素原位凝膠體外溶蝕時間 根據無膜溶出法測得的該凝膠體外溶蝕時間為8.08h，溶蝕率為95.09%，提示該凝膠有較長的作用時間。見表2。

4 討論

臨床一線使用的抗結核藥物有異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、鏈霉素、乙胺丁醇等。其中異煙肼口服生物利用度可達90%，殺菌作用強大，但是異煙肼在用藥過程中廣泛分布于全身體液和組織，易使人體產生肝臟損害、血液系統疾病、周圍神經炎等諸多不良反應，影響其臨床使用的安全性[1]。鏈霉素口服不易吸收，肌內注射后吸收良好，但因其常見的不良反應包括共濟失調、聽力障礙、耳鳴等在臨床用藥中受限。所以，為降低藥物不良反應，增加臨床療效，開發具有良好靶向性、緩釋性的新制劑已迫在眉睫。

表2 載藥凝膠體外溶蝕考察結果

由于異煙肼和鏈霉素都易溶于水，可以有效分散于水溶性原位凝膠中，從而發揮緩釋作用。文獻報道，泊洛沙姆的毒性很低，且易溶于水，生物相容性也較不溶性的緩釋凝膠基質更好[6]，所以本實驗優先選擇泊洛沙姆作為凝膠基質。P407 是最常用的原位凝膠載體材料，形成凝膠的濃度較低，25℃時為20%，P407 濃度越高，凝膠黏度越高，膠凝溫度越低，黏附作用力越強，此為反向凝膠的性質[7]。單純使用P407 溶液作為凝膠基質存在一些缺點，比如機械強度差，溶蝕快、作用時間短、無法得到理想的膠凝溫度等，所以加入其同系列化合物P188 以提高膠凝速度和減慢藥物釋放[8]，加入HPMC 來提高P407 的生物黏附力[7]。采用正交設計優化處方工藝，按照優化處方設計制備的異煙肼-鏈霉素原位凝膠在室溫和體溫下都較穩定，膠凝溫度適合人體體溫，體外溶蝕時間較長，有利于異煙肼-鏈霉素在用藥部位的滯留，對提高患處藥物濃度和延長作用時間有較好的效果。

流變學特性是原位凝膠評價的重要指標之一。對于注射用溫敏原位凝膠，其在體外時為流動性強的液體，黏度較低，用細小針頭就能順利注射；而在體溫下黏度迅速增加形成凝膠[6]。本實驗所制備的異煙肼-鏈霉素溫敏原位凝膠能夠較好地符合這一要求。

雖然本實驗對該新型制劑進行了初步評價，且體外性質考察基本符合臨床應用，但藥物釋放與關節腔體液的接觸面積、體液的分泌量及關節活動等都有關[9]，其在體內是否能達到所需的治療濃度，給藥后有何不良反應等尚待進一步研究，以期為臨床使用提供可靠的藥物劑型。