丁基苯酞對創(chuàng)傷性腦損傷模型大鼠神經(jīng)功能的改善作用*

何 云，桂水清，黃賢鍵，朱棟梁

（廣東省深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035）

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題，但目前尚缺乏有效的治療方法［1］。除了在創(chuàng)傷事件發(fā)生后立即發(fā)生原發(fā)性機械損傷外，還會繼發(fā)腦損傷神經(jīng)細胞死亡［2］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中，蛋白激酶C 受體1（RACK1）可募集并結合許多激酶和受體，從而達到保護神經(jīng)細胞的目的［3］。近端內質網(wǎng)應激傳感器肌醇酶1（IRE1）信號通路的激活也可通過RACK1 的直接結合而觸發(fā)［4］。激活的IRE1 通過編碼轉錄因子X-box 結合蛋白1（XBP1）發(fā)揮作用，并協(xié)調如葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）等未折疊蛋白反應（UPR）基因的表達［5］。有研究表明，IRE1／XBP1 信號通路在CNS 疾病中可預防神經(jīng)細胞凋亡。低表達的XBP1 可抑制神經(jīng)細胞中淀粉樣β 神經(jīng)毒性，而XBP1 的過表達會觸發(fā)帕金森病模型小鼠中多巴胺能神經(jīng)細胞的變性［6-7］。丁基苯酞（NBP）已被批準用于預防腦缺血［8］，但尚不清楚NBP 是否對TBI模型大鼠的神經(jīng)功能有改善作用，本研究中擬就此問題進行探討?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：HBS-1096B 型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；ASP300S 型組織脫水機、1150 型包埋機、RM2255 型全自動輪轉切片機（德國Leica 公司）；E400 型光學顯微鏡（日本Nikon 公司）；GelDoc-It2 310型凝膠成像儀（美國UVP 公司）；165-8033 型垂直電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

試劑：NBP（美國Sigma 公司）；蘇木素染色液（上海碧云天生物技術研究所）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，均購自上海生工生物工程有限公司；蛋白抽提試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；RACK1、磷 酸 化 IRE1（p - IRE1）、XBP1、GRP78、β-actin 抗體（美國Santa Cruz 公司）；純化山羊抗小鼠IgG 二抗（武漢艾美捷科技有限公司）；水為純化水。

動物：SD 大鼠，雄性，體質量（200±20）g，購自吉林大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（吉）2017-0001，動物質量合格證號為2018112304。在環(huán)境溫度（23±2）℃，相對濕度60% ～70%，光照12 h 明暗交替環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1 周后進行試驗。

1.2 方法

模型制備及分組、給藥：將60 只大鼠分為假手術組（等體積生理鹽水），模型組（等體積生理鹽水），NBP 低、中、高劑量組（10，20，40 mg／kg），各12 只。采用改良Feeney 自由落體撞擊法制備大鼠TBI 模型。麻醉后將大鼠俯臥固定在立體定位儀上，備皮消毒后切開頭部皮膚，于冠狀縫后中線右側開3 cm 磨取5 mm 的骨窗，用顱腦撞擊器在硬腦膜上放置1 個與骨孔大小吻合的墊片及直徑4 mm 的撞針，用40 g 砝碼從40 cm 高處自由落體撞擊撞針，造成大鼠右側大腦半球腦挫裂傷。假手術組只磨取骨窗，不予撞擊?？p合切口，待大鼠麻醉清醒后，各組大鼠分別腹腔注射相應藥物（注射體積每100 g體質量2 mL），每日1 次，連續(xù)7 d［9］。

神經(jīng)功能缺損評分：末次給藥1 h 后評估神經(jīng)功能，完全無法走路計5 分，無法自發(fā)行走和失去知覺計4 分，走路時向內傾斜計3 分，走路時向內旋轉計2 分，前爪無法完全伸展計1 分，無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)計0 分。

腦組織含水量檢測：處死大鼠，取腦組織，去除軟腦膜和凝血塊，每組4 只以福爾馬林固定，4 只以液氮保存，4 只進行腦含水量測定。取右側腦半球，稱定體質量后置60 ℃烤箱中烤至恒重，再次稱定質量，計算腦組織含水量。含水量＝（濕質量-干質量）／濕質量×100%。

腦細胞凋亡檢測：制備常規(guī)腦組織病理石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟和無水乙醇脫水后，以TUNEL 法采用熒光顯微鏡檢測凋亡細胞，以碘化丙啶（DAPI）反染細胞核，計算陽性細胞率。

MDA 和SOD 水平檢測：制備腦組織勻漿，吸取上清液，按酶聯(lián)免疫吸附法測定MDA 和SOD 水平。

RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78 表達水平檢測：采用western blot 法。制備腦組織勻漿，取50 mg，加入1 mL預冷蛋白抽提試劑，冰浴2 h，離心，取上清液，100 ℃煮10 min 進行變性。各組取20 μg 上樣，轉模，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入RACK1（1 ∶400）、p - IRE 1（1 ∶200）、XBP1（1 ∶200）、GRP78（1 ∶300）一抗，4 ℃孵育過夜，回收一抗，TBST 清洗2 次，加入二抗（1 ∶5 000），在室溫下孵育30 min，回收二抗，TBST 清洗3 次，加入ECL 化學發(fā)光試劑，將PVDF 膜放入暗盒中，壓上X 膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。然后，通過Image J 軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內參條帶灰度比值為各目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件分析。定量資料以表示，行LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對神經(jīng)功能缺損評分和腦組織含水量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦組織含水量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，NBP 高、中、低劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦組織含水量顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 對腦細胞凋亡的影響

與假手術組大鼠細胞凋亡指數(shù)［（0.48±0.17）%］比較，模型組大鼠［（6.30±0.52）%］顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，NBP 低、中、高劑量組大鼠凋亡指數(shù)［（3.62±0.48）% ，（2.51±0.37）% ，（1.10±0.27）% ］均顯著降低，且呈劑量依賴關系（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3 對腦組織勻漿中MDA 和SOD 水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織勻漿中MDA水平顯著升高，SOD 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，NBP 低、中、高劑量組大鼠腦組織勻漿中MDA水平顯著降低，SOD 水平顯著升高，且呈劑量依賴關系（P＜0.05）。詳見表2。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦組織含水量比較（±s，n ＝4）Tab.1 Comparison of neurological deficit score and brain water content of rats in each group（±s，n ＝4）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦組織含水量比較（±s，n ＝4）Tab.1 Comparison of neurological deficit score and brain water content of rats in each group（±s，n ＝4）

注：與假手術組比較，a P ＜0.05；與模型組比較，b P ＜0.05；與NBP 低劑量組比較，c P ＜0.05；與NBP 中劑量組比較，d P ＜0.05。表2、表3 同。Note：Compared with those in the sham operation group，a P ＜0.05；compared with those in the model group，b P ＜0.05；compared with those in the NBP low-dose group，c P ＜ 0.05；compared with those in the NBP medium-dose group，d P ＜0.05；as well as Tab.2 and Tab.3.

組別假手術組模型組NBP 低劑量組NBP 中劑量組NBP 高劑量組劑量（mg／kg）10 20 40神經(jīng)功能缺損評分（分）0 3.40±0.28a 2.84±0.36b 1.88±0.27bc 1.15±0.12bcd腦組織含水量（%）77.54±0.28 82.23±0.49a 80.68±0.51b 79.25±0.35bc 78.91±0.41bcd

2.4 對 腦 組 織 勻 漿 中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78 表達水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織勻漿中RACK1 水平顯著降低，p-IRE1，XBP1，GRP78 水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，NBP 低、中、高劑量組大鼠腦組織勻漿中RACK1 水平顯著升高，p-IRE1，XBP1，GRP78 水平均顯著降低，且呈劑量依賴關系（P＜0.05）。詳見表3 及圖2。

A. 假手術組 B. 模型組 C.NBP 低劑量組 D.NBP 中劑量組 E.NBP 高劑量組圖1 大鼠腦細胞凋亡情況A.Sham operation group B.Model group C.NBP low-dose group D.NBP medium-dose group E.NBP high-dose groupFig.1 Apoptosis of brain cells of rats

表2 各組大鼠腦組織勻漿中MDA 和SOD 水平比較（±s，n ＝4）Tab.2 Comparison of MDA and SOD levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

表2 各組大鼠腦組織勻漿中MDA 和SOD 水平比較（±s，n ＝4）Tab.2 Comparison of MDA and SOD levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

組別假手術組模型組NBP 低劑量組NBP 中劑量組NBP 高劑量組劑量（mg／kg）10 20 40 MDA（nmol／mg）4.78±0.57 12.09±1.82a 9.52±0.43b 7.68±0.83bc 6.02±0.70bcd SOD（U／g）24.35±3.42 7.34±0.40a 9.75±0.98b 13.84±2.46bc 17.28±3.61bcd

表3 各組大鼠腦組織勻漿中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78表達水平比較（±s，n ＝4）Tab.3 Comparison of RACK1，p-IRE1，XBP1 and GRP78 expression levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

表3 各組大鼠腦組織勻漿中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78表達水平比較（±s，n ＝4）Tab.3 Comparison of RACK1，p-IRE1，XBP1 and GRP78 expression levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

組別假手術組模型組NBP 低劑量組NBP 中劑量組NBP 高劑量組劑量（mg／kg）10 20 40 RACK1 3.28±0.41 0.62±0.07a 1.28±0.25b 1.83±0.37bc 2.69±0.13bcd p-IRE1 0.42±0.05 1.82±0.29a 1.53±0.09b 1.30±0.21bc 0.94±0.08bcd XBP1 0.45±0.07 1.27±0.28a 0.85±0.14b 0.73±0.09bc 0.55±0.06bcd GRP78 0.19±0.04 1.76±0.18a 1.27±0.25b 0.54±0.04bc 0.33±0.05bcd

3 討論

TBI 24 h 后，外傷皮質周圍氧化產(chǎn)物（MDA）水平升高，抗氧化酶活性減弱［10］。本研究中，NBP 可減輕TBI模型大鼠的氧化應激水平，減輕腦水腫癥狀，并改善神經(jīng)功能評分，抑制神經(jīng)細胞凋亡。氧化應激在TBI 病理過程中扮演重要作用。為了緩解氧化應激，細胞激活UPR 級聯(lián)反應，其目的是通過減少錯誤折疊蛋白的負荷來重建內質網(wǎng)蛋白穩(wěn)定，抑制細胞凋亡［11］。最保守的UPR 信號傳導途徑是由IRE1 的激活引發(fā)的，IRE1 在增強細胞存活中起關鍵作用［12］。RACK1 是IRE1 信號傳導的關鍵調節(jié)劑。敲除RACK1 的阿爾茨海默?。ˋD）模型，小鼠的大量神經(jīng)細胞凋亡和神經(jīng)功能損傷［13］。本研究中TBI 模型大鼠腦組織中RACK1 水平降低，與上述研究一致。相反，RACK1 過表達可顯著改善腦外傷后的繼發(fā)性腦損傷，NBP 可提高腦組織中RACK1 水平［14］。RACK1 的神經(jīng)保護作用可能是通過激活IRE1 磷酸化來實現(xiàn)的，一旦被激活，IRE1 作為跨膜激酶催化去除編碼XBP1 的內含子，產(chǎn)生剪接的XBP1 mRNA，產(chǎn)生功能性XBP1 蛋白［15］。RE1 磷酸化導致了功能性轉錄因子XBP1 及其下游靶基因GRP78 的產(chǎn)生［16］。RACK1 以葡萄糖刺激或氧化應激反應的方式與IRE1 相互作用，從而激活IRE1。有研究使用IRE1 抑制劑十二烷基苯磺酸（DBSA）進行論證性研究，結果顯示，DBSA 特異性降低IRE1 磷酸化水平而抑制IRE1 的激活［17］。XBP1 充當轉錄因子，結合細胞核中的應激元件啟動子并促進GRP78 表達，以恢復蛋白質的正確構象，并維持神經(jīng)細胞穩(wěn)態(tài)。研究表明，磷酸化的IRE1 和XBP1 表達在試驗性腦缺血和創(chuàng)傷后應激障礙模型動物中增加，并促進神經(jīng)細胞凋亡［18］。本研究結果顯示，NBP 抑制了IRE1／XBP1 信號通路，降低了腦組織中GRP78 水平。

A. 假手術組 B. 模型組 C.NBP 低劑量組D.NBP 中劑量組 E.NBP 高劑量組圖2 大鼠腦組織勻漿中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78表達水平A.Sham operation group B.Model group C.NBP low-dose group D.NBP medium-dose group E.NBP high-dose groupFig.2 Expression levels of RACK1，p-IRE1，XBP1 and GRP78 in brain homogenate of rats in each group

綜上所述，NBP 對TBI 模型大鼠神經(jīng)功能有一定改善作用，其機制與抑制IRE1／XBP1 信號通路有關。