高效液相色譜法測(cè)定腦心舒口服液中雜質(zhì)5-羥甲基糠醛含量

李 玲，吳 琦，王婷婷

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222006）

腦心舒口服液主要成分為蜜環(huán)菌濃縮液、蜂王漿，輔料為蜂蜜、香精、苯甲酸鈉，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、鎮(zhèn)靜安神功效［1］。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二十冊(cè)）》［1］，標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)雜質(zhì)5-羥甲基糠醛（5-HMF）的檢查項(xiàng)。蜂蜜作為矯味劑（用量為45%）添加到制劑中，蜂蜜中果糖和葡萄糖的總量不少于60%［2］。5-HMF 是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水生成的醛類化合物，腦心舒口服液在制備過(guò)程包括將蜂蜜在90 ～100 ℃下加熱煉制環(huán)節(jié)［1］，故極易降解出雜質(zhì)5-HMF。5-HMF 為第2 類基因毒性雜質(zhì)［3］，對(duì)人體有致敏性、致癌性、神經(jīng)毒性、基因毒性等副作用［3-6］。雜質(zhì)尤其是基因毒性雜質(zhì)作為影響藥品安全性的關(guān)鍵因素，目前已成為藥品評(píng)價(jià)和研究的重點(diǎn)［7］。本試驗(yàn)中建立了測(cè)定腦心舒口服液中5-HMF 含量的高效液相色譜法，旨在為制劑的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1.5-羥甲基糠醛A. 對(duì)照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對(duì)照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.5 -hydroxymethylfurfuralA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀，包括Empower 軟件（美國(guó)Waters 公司）；KH-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；BP211D 型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）。

1.2 試藥

5 -HMF 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111626-201912，含量為99.2%）；腦心舒口服液（市售中藥制劑）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～13 min 時(shí)10%A，13 ～14 min 時(shí)10%A→80%A，14 ～20 min 時(shí)80%A，20 ～21 min 時(shí)80%A→10%A，21～30min 時(shí)10%A）；流速：1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：284nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取5-HMF 對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇-水（1 ∶1，V／ V）制成每1 mL 含5-HMF 102.2 μg的對(duì)照品貯備液；精密吸取2 mL，置20 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1 ∶1，V／ V）定容，搖勻，制成每1 mL 含5-HMF 10.22 μg 的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密量取樣品1 mL，置20 mL 容量瓶中，加甲醇-水（1 ∶1，V ／ V）超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理，并定容，搖勻，濾過(guò)，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按腦心舒口服液處方和工藝制備不含蜂蜜的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果理論板數(shù)按5-HMF 峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與5-HMF 對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明專屬性良好。詳見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2 項(xiàng)下5-HMF 對(duì)照 品 貯 備 液0.04，0.20，1.00，2.00，4.00，10.00，15.00 mL，分別置20 mL 容量瓶中，加甲醇-水（1 ∶1，V／ V）定容，搖勻，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取20 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以5-HMF 質(zhì)量濃度（μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝142 764X-32 163，r＝0.999 7（n＝7）。結(jié) 果 表 明，5-HMF 質(zhì) 量 濃 度 在0.204 ～76.65 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限、檢測(cè)限考察：將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S／ N）10 ∶1，3 ∶1分別計(jì)算定量限和檢測(cè)限。結(jié)果定量限和檢測(cè)限分別為0.21，0.07 μg／mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果5-HMF 峰面積的RSD為0.37%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為200208）適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，12，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果5-HMF 峰面積的RSD為1.16%（n ＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為200208）適量，平行6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果5-HMF 峰面積的RSD為1.75%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品（批號(hào)為200208）0.5 mL，共9 份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery tests（n ＝9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取12 批樣品各適量，分別按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品中5-HMF 的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品信息及5 -HMF 含量測(cè)定結(jié)果（mg／mL，n ＝12）Tab.2 The information of the samples and the results of content determination of 5 -HMF in the samples（mg／mL，n ＝12）

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.01%磷酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動(dòng)相體系進(jìn)行對(duì)比考察，并對(duì)不同梯度洗脫比例進(jìn)行摸索，最終確定采用甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。在此色譜條件下，5-HMF 峰形對(duì)稱，理論板數(shù)最佳，并能與相鄰成分峰達(dá)到完全分離。

耐用性試驗(yàn)中適當(dāng)改變色譜條件，如流動(dòng)相中磷酸溶液體積分?jǐn)?shù)（0.08% ，0.10% ，0.12% ）、流速（0.9，1.0，1.1 mL／min）、柱溫（25，30，35 ℃），結(jié)果各考察因素在耐用性范圍內(nèi)變動(dòng)時(shí)，供試品中5-HMF 含量測(cè)定結(jié)果基本一致，表明流動(dòng)相、流速和柱溫在一定限度內(nèi)變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性較好。

試驗(yàn)中收集了12 批市售腦心舒口服液（10 個(gè)不同生產(chǎn)企業(yè)），含量測(cè)定結(jié)果表明，12 批樣品中均檢出5-HMF，且各批次樣品間差異較大，最高質(zhì)量濃度與最低質(zhì)量濃度相差約200 倍，可見(jiàn)市售腦心舒口服液質(zhì)量參差不齊。2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定蜂蜜中5-HMF含量不得過(guò)0.004%［2］，按腦心舒口服液的處方工藝（蜂蜜占45%），理論計(jì)算制劑中5-HMF 含量最高為0.018 mg／mL，所檢測(cè)樣品中僅1 批的5-HMF 含量低于0.018 mg／mL。可見(jiàn)，腦心舒口服液中5-HMF 的來(lái)源很可能是制劑在處方制備過(guò)程中蜂蜜加熱煉制（90 ～100 ℃）［1］降解產(chǎn)生，有的廠家的5-HMF 含量尤其高，也可能為使用了劣質(zhì)蜂蜜作為輔料或蜂蜜加熱煉制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致。

腦心舒口服液的用量為1 次10 mL，1 日2 次，而腦心舒口服液中5-HMF 的質(zhì)量濃度范圍為0.006 1 ～1.247 mg ／ mL，則 最 大 日 暴 露 量 為24.94 mg，遠(yuǎn) 超5 -HMF 作為第2 類基因毒性雜質(zhì)限度的要求［3］。因毒性雜質(zhì)在低濃度時(shí)即可造成人體遺傳物質(zhì)的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致基因突變，甚至促使腫瘤發(fā)生［7］。蜂蜜雖是腦心舒口服液中的輔料，但輔料也是影響藥品安全性的重要因素，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越重視輔料的研究，輔料中降解雜質(zhì)的毒副作用也應(yīng)引起足夠重視。因此建議，生產(chǎn)廠家優(yōu)化處方制備工藝，改善樣品存儲(chǔ)溫度或選用更優(yōu)質(zhì)的輔料，以降低樣品中5-HMF 的含量。同時(shí)，對(duì)5-HMF 進(jìn)行質(zhì)量控制，并納入腦心舒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以提高產(chǎn)品的質(zhì)量和用藥安全。