芪連降糖片微生物限度檢查方法適用性研究

沈 銳，周 劍，嚴海元，沈 偉，趙壯志

（1. 重慶市永川食品藥品檢驗所，重慶 402160； 2. 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121；3. 重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶 401121）

芪連降糖片用于治療2 型糖尿病，有生津止渴、活血化瘀功效，臨床多用于消除糖尿病患者的內熱，緩解其氣虛。其主要成分為黃芪、黃連等中藥材，黃芪中黃芪甲苷可降血糖，調血脂，抑制炎癥，改善血管病變等；黃連中黃連素能促進胰島素分泌，防止肝糖原異生［1］。黃芪甲苷對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抑制作用，故黃芪對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌有強烈的抑制作用，但對酵母菌、黑曲霉等真菌類幾乎無抑制作用［2］；同抗菌肽結合后的黃芪對銅綠假單胞菌也有抑制作用［3］。黃連水提物黃連素主要是對革蘭陽性球菌（如金黃色葡萄球菌）和革蘭陰性短桿菌（如大腸埃希菌）抑制作用明顯［4］。由于上述成分的抑菌作用，常規法檢查結果不能真實反映該藥物的微生物污染情況。本研究中采取稀釋法、薄膜過濾法與平皿法進行漸進式研究，建立了芪連降糖片的微生物限度適用性檢查方法［5］。現報道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1.1 儀器

TE2101-L 型電子天平（德國Sartorius 公司）；SPX-150F-Ⅱ型立式生化培養箱（上海龍躍儀器設備公司）；MJ-150-Ⅰ型霉菌培養箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；GI80TW 型立式高壓蒸汽滅菌器（廈門致微儀器有限公司）；ZWF-110X50 型恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；MZ-301 型微生物限度儀（杭州美卓生物科技有限公司）；BX53F 型顯微鏡帶成像系統（日本Olympus 株式會社）；VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統（法國生物梅里埃股份有限公司）。

1.2 試藥

芪連降糖片（首都醫科大學某附屬醫院，批號為20191201，規格為每片0.56 g）；pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋 白 胨 緩 沖 液、0.1% 蛋 白 胨 緩 沖 液（0.1% Peptone Buffer）、胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養基、胰酪大豆胨液體（TSB）培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）培養基、麥康凱液體（MacConkey Broth）培養基、麥康凱瓊脂（MacConkey Agar）培養基，均購自北京三藥科技開發公司；氯化鈉（成都科隆化學品有限公司）。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白 色 念 珠 菌［CMCC（F）98001］、黑 曲 霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］均由中國醫學細菌保藏管理中心提供。

2 方法與結果

2.1 微生物計數方法學試驗

2.1.1 培養條件與質控標準

按2015 年版《中國藥典（四部）》微生物限度檢查法的要求，本試驗需氧菌在35 ℃下培養72 h；霉菌和酵母菌在25 ℃下培養120 h，均逐天觀察；菌落數接種量控制在102cfu／mL 以內。計算回收比值，回收比值＝（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）／菌液對照組菌落數，比值須在0.5 ～2.0 范圍內。

2.1.2 菌液及溶液制備

菌液：將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌標準工作菌株用無菌生理鹽水制成含菌量≤104cfu／mL 的菌懸液；將黑曲霉孢子用無菌生理鹽水加入0.05%聚山梨酯80 制成含菌量≤104cfu／mL 的菌懸液。最終加入供試品溶液中的含菌量≤102cfu／mL。

供試品溶液：稱取供試品10 g，以pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液，稀釋至100 mL，經45 ℃水浴搖床振蕩20 min，將其混勻，制成1 ∶10 供試品溶液。取供試品溶液20 mL，加稀釋液80 mL，制成1 ∶50供試品溶液。

2.1.3 計數方法適用性試驗

平皿法：取1 ∶10 供試品溶液5 份，分別加入藥典規定的5 種試驗菌混懸液，使供試品溶液中含菌量≤102cfu／mL，作為試驗組；另取1 份作為供試品對照組。菌液對照組，以稀釋液替代供試品溶液，分別加入5 種試驗菌液。充分溶解混勻后，各移取1 mL 置2 個相應的無菌平皿（90 mm）中，分別傾注TSA，TSB，SDA 培養基。結果金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收比值超出0.5 ～2.0 范圍，說明1 ∶10 供試品溶液對這兩種菌有較強抑菌性；霉菌和酵母菌總數計數中，2 種試驗菌回收比值均在0.5 ～2.0 內，說明霉菌和酵母菌計數可采用常規平皿法。詳見表1。

稀釋法：取1 ∶50 供試品溶液6 份，照平皿法操作。結果試驗菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收比值略有改善，但仍超出0.5 ～2.0 范圍，證明稀釋法可降低供試品的抑菌性，但未完全消除其抑菌性。詳見表1。

表1 需氧菌、霉菌、酵母菌總數預試驗結果（平皿法／稀釋法／薄膜過濾法，n ＝3）Tab.1 Pre-test results of the determination of the total number of aerobic bacteria，moulds and yeasts（plate method／dilution method／membrane fillration method，n ＝3）

薄膜過濾法：只做需氧菌總數測定方法適用性。取1 mL 1 ∶10 供試品溶液，置50 mL pH 7.0 NaCl-蛋白胨緩沖液中，薄膜過濾，用0.1%蛋白胨緩沖液300 mL 沖洗3 次（每次100 mL），試驗組在最后一次沖洗液中加入含菌量≤102cfu 的試驗菌；供試品對照組以稀釋液代替菌液；菌液對照組以稀釋液代替供試品溶液。將菌面朝上的濾膜貼于TSA 培養基平板上（90 mm），每株試驗菌平行制備2 個平皿。結果各需氧菌回收比值均在0.5 ～2.0 范圍內，表明該方法可用于需氧菌總數測定。詳見表1。

2.1.4 驗證試驗

取樣品，按上述方法進行3 次獨立試驗，驗證計數方法適用性。結果金黃色葡萄球菌（TSA）、銅綠假單胞菌（TSA）、枯草芽孢桿菌（TSA）、白色念珠菌（TSA）、黑曲霉（TSA）、白色念珠菌（SDA）、黑曲霉（SDA）的回收率比值依次為0.84，0.89，0.83，0.86，0.83，0.69，0.75，均符合要求。故宜采用取1 mL 1 ∶10 供試品溶液置50 mL pH 7.0 NaCl-蛋白胨緩沖液過濾，每膜沖洗量300 mL 進行需氧菌總數計數；平皿法進行霉菌和酵母菌總數計數。

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗

2.2.1 菌液及溶液制備

將標準工作菌株大腸埃希菌用無菌生理鹽水制成菌懸液，加入供試品溶液中的菌落數≤102cfu。同2.1.2項下方法制成1 ∶10 供試品溶液。

2.2.2 方法適用性試驗

取2.2.1 項下1 ∶10 供試品溶液10 mL 及≤102cfu試驗菌的菌懸液（大腸埃希菌），接種至100，200 mL TSB 培養基中，混勻，作為試驗組A 和B；供試品對照組以稀釋液代替菌液；菌液對照組以稀釋液代替供試品溶液。TSB 培養基35 ℃培養18 h，取1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養基中，44 ℃培養24 h；取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，35 ℃培養18 h。

2.2.3 適用性試驗結果

采用平皿法，以100 mL TSB 培養基作為增菌液，麥康凱液體培養基和麥康凱瓊脂培養基平板上均呈陽性，但大腸埃希菌濃度較低；稀釋法以200 mL TSB 培養基作為增菌液，陽性明顯，菌落生長較好。以經濟高效為前提綜合考慮，最終以100 mL TSB 培養基作為增菌液，已能滿足控制菌檢查要求。結果見表2（表中麥康凱液體培養基中，+為渾濁，紫色變黃色；-為澄清，顯紫色；+ -為輕微渾濁，且紫色變淡黃色。麥康凱瓊脂培養基平板中，+為桃紅色典型菌落生長；-為無典型菌落生長；+ -為呈較少桃紅色、不透明菌落）。

表2 大腸埃希菌控制菌檢查方法適用性試驗結果（n ＝3）Tab.2 Results of the suitability tests for the control bacteria of Escherichia coli（n ＝3）

2.2.4 驗證試驗

取芪連降糖片，進行3 次獨立試驗。以100 mL 胰酪大豆胨液體培養基作為增菌液，結果可信、有效，表明該方法可行。

2.3 微生物限度檢查

按2 次驗證試驗方法對樣品進行微生物限度檢查。樣品中需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數均低于10 cfu／g，未檢出控制菌大腸埃希菌，符合2015 年版《中國藥典（四部）》通則1107“非無菌藥品微生物限度標準”相關要求。

3 討論

2015 年版《中國藥典》相較2010 年版，在微生物限度檢查中改變了加菌方式及培養基，在更貼合國外藥典的同時兼顧了中國特色［6］。在供試品制備階段加入菌液，使菌液和供試液充分混合，更好地模擬了樣品污染情況，同時樣品中的成分能充分作用于病原菌，更好地反映藥物對病原菌是否有抑制作用，但也增加了試驗操作的難度［7］。

本品主要成分黃芪和黃連兩味藥材具有較強的抑菌作用，驗證方法的選擇中顯示，常規法＞培養基稀釋法＞培養基稀釋-薄膜過濾聯用法［8］。本研究中在選擇方法時從常規法到稀釋法逐步試驗，測定需氧菌總數時采用1 ∶10 供試品溶液平皿法，增加稀釋液體積，均無法消除供試品的抑菌性。中成藥的抑菌性無法選擇合適的中和劑消除抑菌性，薄膜過濾法能直接徹底消除抑菌作用，計數結果準確度高［9］。中成藥固體制劑中含有大量不溶性輔料，預試驗中建立了培養基稀釋-薄膜過濾聯用法進行沖洗，每膜以300 mL 及500 mL 為沖洗液，結果試驗菌均生長良好，最終確定以50 mL pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，300 mL 0.1%蛋白胨緩沖液沖洗3 次，每次100 mL。選用的方法操作簡捷高效，加樣回收率好［10］。在控制菌的方法學驗證中，很多文獻均首要考慮是否呈強陽性，而忽略了在方法學建立時應同時考慮快捷、經濟，本試驗中對控制菌增菌培養基體積的選擇兼顧了以上原則。

在對黑曲霉進行計數時，應逐天觀察，由于黑曲霉易蔓延生長，不易計數，所以白色菌絲生長出來就應計數。另外，以稀釋液作為空白對照，計數與控制菌檢查均應顯陰性，否則試驗失敗需重新進行［11］。2015 年版《中國藥典》中非無菌微生物計數主要還是以中成藥及化學藥為主，未涉及中藥材，2020 年版《中國藥典》已將中藥材納入其中，越來越多的研究涉及中藥飲片的微生物計數檢查［12-13］，如楊瑞琦等［14］的肉豆蔻飲片微生物計數研究及李艷等［15］的6 種中藥飲片微生物檢測狀況分析等，為后續不斷深入研究奠定了基礎。