應用實時熒光PCR快速檢測血培養標本中的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌*

李 媛，熊 櫻，易佰城，陳國金，彭 莎，孫懷超，楊友華，何 超

1.四川省德陽市綿竹市人民醫院檢驗科，四川德陽 618200；2.四川大學華西醫院實驗醫學科，四川成都 610041

近年來，由于碳青霉烯類藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率逐漸升高，給臨床治療帶來嚴峻挑戰[1-3]。血流感染是一種嚴重的全身感染性疾病，患者住院時間長，病死率高，應盡快精準治療以改善患者預后。以往耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)血流感染的實驗室診斷主要依賴于血培養技術，該技術操作流程主要涉及樣本孵育、儀器報陽后轉種、菌株分離鑒定以及體外藥敏試驗，從血培養儀器報陽到出具藥敏報告往往需要2～3 d，不能盡早指導臨床治療。因此，縮短CRKP的實驗室檢測時間，為CRKP相關血流感染提供早期快速的診斷依據，以改善患者臨床結局，具有非常重要的臨床價值。本研究旨在應用實時熒光PCR(RT-PCR)技術快速檢測血培養標本中的肺炎克雷伯菌并進行耐藥基因篩查，為CRKP相關血流感染提供早期診治依據，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 標準菌株：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705(碳青霉烯類耐藥株)和肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706(碳青霉烯類敏感株)購自成都好映象科技有限公司。臨床分離株：18株CRKP和30株非肺炎克雷伯菌(蜂房哈夫尼亞菌2株，植生拉烏爾菌3株，解鳥氨酸拉烏爾菌1株，產酸克雷伯菌2株，沙門菌屬1株，丙型副傷寒沙門菌1株，洋蔥伯克霍爾德菌1株，奇異變形桿菌2株，普通變形桿菌1株，銅綠假單胞菌4株，大腸埃希菌4株，陰溝腸桿菌2株，產氣腸桿菌1株，摩根摩根菌1株，雷氏普羅威登斯菌1株，嗜麥芽窄食單胞菌2株，鮑曼不動桿菌1株)為綿竹市人民醫院檢驗科(以下簡稱“本實驗室”)于2018年3月至2019年7月從臨床標本中分離的菌株。耐藥基因陽性對照菌株DNA來自四川大學華西醫院實驗醫學科，均已測序驗證。

1.2儀器與試劑 細菌DNA提取試劑盒和熒光定量PCR反應試劑盒(TaKaRa寶生物)。SLAN-96P實時熒光定量PCR儀(上海宏石)，KDC-140HR高速冷凍離心機(中科中佳)，BACT/ALERT3D全自動血培養儀(法國生物梅里埃)等。

1.3方法

1.3.1血培養中肺炎克雷伯菌的快速檢測

1.3.1.1細菌DNA的提取 挑取平板上純菌落，用0.85%的NaCl溶液配制成0.5 MCF的菌懸液(相當于1.0×108cfu/mL含菌量)，再依次稀釋成濃度為105、104、103、102、10、1、0.5和0.1 cfu/mL的菌懸液，取不同濃度菌懸液分別注入血培養瓶，搖勻后放入血培養儀，儀器報陽后，按照差速離心法[4](用無菌注射器抽取報陽的血培養瓶中標本4.0 mL，加入6.0 mL無菌生理鹽水，混勻，180×g低速離心10 min；取3 mL上清液轉至新的無菌管中，以14 170×g離心2 min；棄上清液，加入1.0 mL無菌生理鹽水混勻，以14 170×g離心1 min；棄上清液，加入1.0 mL無菌生理鹽水混勻，以14 170×g離心2 min；棄上清液，菌懸液沉淀用于DNA提取備用)將菌懸液濃縮，根據細菌DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA，置-20 ℃保存待用。

1.3.1.2引物合成 肺炎克雷伯菌Khe基因引物和探針序列如下[5]：正向引物KheF，5′-TGGGGATCCACCACGA-3′；反向引物KheR，5′-AGAGATAGCCGTTTATCCACAC-3′；探針KheTmp，5′-6FAM-GAGGAAGAGTTCATCTACGTGCTGGAGG-BH Q1-3′，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3.1.3Khe基因RT-PCR體系 在25 μL反應體系中，加入1×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5 μL，正向和反向引物(0.2 μmol/L)各0.5 μL，探針(0.2 μmol/L)0.5 μL，DNA模板2 μL，滅菌水9 μL。肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705、ATCC BAA 1706為反應體系的內部質控。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，1個循環；94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。退火階段檢測熒光(FAM通道)，隨后使用上海宏石96P軟件進行分析得到循環閾值(CT值)，以CT值≤35判定為陽性。

1.3.1.4靈敏度試驗 轉種復蘇肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705和ATCC BAA1706，用1.3.1.1方法提取細菌DNA，用1.3.1.3擴增體系進行熒光PCR檢測，測定其最低檢測限值。

1.3.1.5特異度試驗 將本實驗室收集的18株CRKP和30株非肺炎克雷伯菌進行轉種復蘇，按照1.3.1.1模擬血培養報陽，提取細菌DNA，按照1.3.1.3進行熒光PCR檢測。

1.3.1.6重復性試驗 按照1.3.1.4和1.3.1.5進行3次重復試驗。

1.3.2耐藥基因的快速篩查

1.3.2.1多重RT-PCR體系 取肺炎克雷伯菌標準菌株和耐藥基因陽性對照菌株DNA，用多重PCR方法擴增KPC、NDM、VIM、IMP 4種耐藥基因，引物序列見表1[6]。使用兩個多重RT-PCR反應體系：一個用于檢測KPC和NDM，另一個用于檢測VIM和IMP。加樣體系如下：Premix Ex Taq(1×)12.5 μL，引物和探針分別為0.5 μL，DNA模板2 μL，滅菌水6 μL(空白對照滅菌水加8 μL)。肺炎克雷伯菌16S rRNA作為每種反應體系的內部質控。擴增體系：95 ℃預變性30 s，1個循環；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，40個循環。在退火/延伸階段采集熒光(FAM通道收集KPC/VIM數據，HEX通道收集NDM/IMP數據；ROX通道收集內部質控數據)，隨后使用上海宏石96P軟件進行分析得到CT值，以CT值≤35判定為陽性。

表1 用于碳青霉烯酶基因擴增的引物和探針序列

1.3.2.2CRKP臨床分離株模擬標本的快速檢測 使用1.3.1.1得到的18株CRKP臨床分離株的血培養模擬標本DNA為模板，用1.3.2.1方法進行檢測。

2 結 果

2.1RT-PCR檢測血培養中肺炎克雷伯菌 采用1.3.1建立的RT-PCR體系對肺炎克雷伯菌標準株模擬血培養報陽標本進行擴增，得到的擴增曲線圖見圖1。

圖1 RT-PCR檢測血培養中肺炎克雷伯菌的曲線圖

2.2靈敏度試驗 除0.1 cfu/mL的菌液標本外，其余標本均檢測到肺炎克雷伯菌，結果顯示本研究的最低檢測限為0.5 cfu/mL。

2.3特異度試驗 除肺炎克雷伯菌菌株的模擬標本外，其他非肺炎克雷伯菌菌株的模擬標本均無典型擴增曲線，方法特異度為100%(48/48)。

2.4重復性試驗 3次重復試驗結果一致，證實該方法有較好的穩定性。

2.5RT-PCR快速篩查耐藥基因 用1.3.2.1建立的RT-PCR方法檢測肺炎克雷伯菌標準株和耐藥基因陽性DNA得到的擴增曲線見圖2和圖3。

圖2 RT-PCR檢測血培養報陽標本中KPC陽性的擴增曲線圖

圖3 RT-PCR檢測血培養報陽標本中NDM陽性的擴增曲線圖

2.6CRKP臨床分離株模擬標本的檢測 18株CRKP檢測出7株攜帶KPC酶基因[38.9%(7/18)]，9株攜帶NDM酶基因[50.0%(9/18)]，1株同時攜帶KPC酶基因和NDM酶基因[5.6%(1/18)]，1株未檢測出任何耐藥基因[5.6%(1/18)]。

3 討 論

血流感染是常見感染性疾病，往往引起患者住院時間延長，住院費用增加，甚至導致不良預后的發生[7-8]。有研究表明，醫院內感染中血流感染病死率為35.0%～60.0%，而在重癥監護病房中的患者，血流感染病死率為31.5%～82.4%[9]。近年來，隨著創傷性診療技術的開展、廣譜抗菌藥物的使用等[10-11]，血流感染的發病率較高，而高毒力和多重耐藥的肺炎克雷伯菌血流感染更是引起了全球的廣泛關注[12]。2018年全國細菌耐藥監測報告顯示，肺炎克雷伯菌在引起血流感染的病原菌中排名第二，僅次于大腸埃希菌[13]。并且，肺炎克雷伯菌臨床分離株對碳青霉烯類藥物的耐藥率從2013年的4.9%上升到2018年的10.1%，總體呈現持續上升的趨勢[13]。近年來，在美國、以色列、意大利和希臘等地區其耐藥率也急劇上升，可高達68.0%[12]。因此，盡早進行病原菌的鑒定和耐藥性分析，對該類細菌相關血流感染的臨床診治至關重要。

目前，血流感染的實驗室檢測主要依賴于血培養，菌株分離鑒定和體外藥敏試驗花費時間較長，不利于該類疾病的早期診治。RT-PCR法作為核酸檢測手段之一，具有較高的靈敏度、特異度和穩定性[14-15]。隨著基層醫院PCR實驗室條件的逐步完備，基于該方法的病原學檢測技術也適宜于基層醫院推廣使用。

Khe基因僅存在于肺炎克雷伯菌中，編碼相對分子質量為19×103的蛋白，可能有溶血素活性，因此可作為鑒定肺炎克雷伯菌的特異性靶標[5]。本研究利用肺炎克雷伯菌特異性引物和探針建立的RT-PCR檢測方法，對18株CRKP和30株非肺炎克雷伯菌的檢測結果顯示，特異度為100%，最低檢測限為0.5 cfu/mL，并且該方法具有較好的穩定性。

已有報道指出，產碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制[16]。實驗室進行碳青霉烯酶的檢測，可為抗菌藥物的選擇和精準治療提供依據。美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)文件推薦采用改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)檢測碳青霉烯酶[17-18]，但該法需要過夜培養，檢測時間相對較長。本研究利用RT-PCR技術在快速檢測血培養標本中肺炎克雷伯菌的同時，進行常見碳青霉烯類耐藥基因篩查，不僅可以確定菌株是否含有碳青霉烯酶，還可以對碳青霉烯酶的類型進行鑒別，并且縮短了試驗周期，可為CRKP相關血流感染的早期精準治療提供依據。

本研究分析了18株本實驗室分離的CRKP菌株制備的血培養模擬標本，發現NDM酶基因的檢出率和KPC酶基因的檢出率分別為50.0%(9/18)和38.9%(7/18)，提示在綿竹市人民醫院產NDM酶和KPC酶可能是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類藥物的主要機制，但CRKP的遺傳學來源有待進一步研究證實。有報道顯示，產NDM-1型CRKP曾主要在印度次大陸播散[16]，但近年來產NDM-1型CRKP在中國多個地區被分離出，如浙江衢州[5.2%(4/76)][19]、南昌[2.4%(1/41)][20]等。但畢穎敏等[21]、付玉冰等[22]報道的上海和唐山地區產KPC酶是CRKP耐藥最主要的機制。另外，本研究中尚有1株未檢測出4種常見的碳青霉烯酶基因，尚待進一步研究其可能的耐藥機制。

綜上所述，本研究應用RT-PCR技術快速檢測血培養中CRKP，該方法快速、靈敏、特異、重復性好，可為該類細菌相關血流感染的早期診治提供依據，也可在基層醫院進行推廣應用。