丙泊酚預處理對膿毒癥大鼠認知功能的影響

楊博 張茂芮 周軍

1西南醫科大學附屬醫院麻醉科（四川瀘州646000）；2西南醫科大學附屬口腔醫院種植科（四川瀘州646000）

膿毒癥（sepsis）是以過度炎癥反應為特征的一種疾病，其發展常以多器官衰竭和死亡為結局［1-2］。膿毒癥導致機體釋放大量炎癥介質和細胞因子，引起難以控制的全身性炎癥反應，發病率和病死率較高。近年來，學者提出膿毒癥會對大腦造成損傷，引發長期性的認知功能障礙，影響患者的生活能力［3］。但目前對膿毒癥引起腦認知功能障礙的具體機制不詳，也尚無明確治療手段。因此，研究膿毒癥所致認知功能障礙的具體原因和機制，對防治腦損傷具有重要意義。丙泊酚是當前臨床用鎮靜藥的代表，近年來，丙泊酚的抗炎和抗氧化應激作用逐漸被大家關注［4-5］。大量研究證實，丙泊酚能夠阻止腫瘤壞死因子α對血腦屏障的破壞從而減輕中樞炎癥［6］，也能調節免疫細胞抑制炎癥反應發生，減輕缺血再灌注損傷［7］。但關于丙泊酚能否改善大鼠膿毒癥所致認知功能障礙目前尚不清楚。本實驗擬研究丙泊酚在膿毒癥所致認知功能障礙的發生、發展過程中的調控作用，并探討其可能涉及的機制，為腦損傷的預防、治療提供更多的研究證據。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑、儀器戊巴比妥（浙江巨化集團有限公司），丙泊酚注射液，批號：2007042（四川國瑞藥業有限責任公司），白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α試劑盒（上海橋杜生物科技有限公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧化物（ROS）試劑盒（南京建成生物工程研究所），總RNA 試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒（Takara，日本），TNF-α（#8184S）、IL-1β（#12703）、IL-6（#12153）（CST，美國），水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司），電子光學顯微鏡（Olympus，日本），全光譜分光光度計（Thermo，美國），實時熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，美國）

1.2 實驗分組及制備模型由西南醫科大學實驗動物中心提供雄性成年SD 大鼠48 只（質量為250 ～320 g）隨機分為四組，每組12只，分別為假手術組（Sham 組）、造模組（C 組）、低劑量丙泊酚預處理組［P1 組，丙泊酚5 mg/（kg·min）］以及高劑量丙泊酚預處理組［P2 組，丙泊酚10 mg/（kg·min）］。所有大鼠適應環境7 d，給予標準大鼠飲食。術前禁食12 h 但自由飲水。麻醉按照35 mg/kg 腹腔注射（戊巴比妥鈉：1%），P1 組和P2 組分別在造模前10 min 持續經尾靜脈泵入丙泊酚注射液，Sham 組和C 組在同樣的時機給予等體積生理鹽水。通過盲腸結扎穿孔法（CLP）制備模型：經正中開腹，充分暴露盲腸，用4-0 絲線結扎2/3 盲腸，用10 號針頭對盲腸腸壁經行打孔，每孔相距3 mm，一共10孔。打孔完畢后輕擠盲腸使腸管內糞便少量溢出，而后逐層縫合腹膜和皮膚。

1.3 水迷宮實驗每只大鼠在平臺上適應環境30 s，然后面向池壁隨機放入水池的四個象限，讓其自由尋找平臺。如果在120 s 內沒找到平臺，則人為引導其游向平臺并停留30 s 后重復實驗。每次給予4 min 間隔休息，每天訓練3 次，連續進行6 d。CLP 術后48 h 行水迷宮反轉實驗。該實驗中，與訓練時不同的是：將平臺置于順時針旋轉180°的對面象限，開始對位訓練。攝像系統跟蹤拍攝大鼠活動軌跡，記錄游泳距離和找到平臺耗費的時間（潛伏期）并計算游泳速度［8］。

1.4 血清炎癥因子檢測經心尖取血，在低溫高速離心機離心處理后取上層血清，參照既往文獻［9］，對IL-1β、IL-6 及TNF-α的表達量進行檢測。

1.5 H&E 染色術后48 h 取材，經多聚甲醛固定大腦標本，包埋、切片等處理后進行H&E 染色。高倍鏡下（400 ×）觀察各切片相同部位的細胞形態，隨機選擇額葉皮質和海馬CA1 區的10 個視野拍照并計數正常神經元數量。

1.6 腦組織炎癥反應測定術后48 h取額葉皮質、海馬CA1 區腦組織，通過Trizol 法提取總RNA。采用TAKARA 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA。根據IL-1β、IL-6 及TNF-α目的基因序列設計并合成引物，引物序列如下：IL-1β上引物：5′-CACCTCTCAAGCAGAGCACAG-3′，下引物：3′-GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC-5′；IL-6 上引物：5′-CCAAGACCATCCAACTCATCTTG-3′，下引物：3′-CACAGTGAGGAATGTCCACAAAC-5′；TNF-α 上引物：5′-CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA-3′，下引物：3′-CTCCTGGTATGAAATGGCAAATC-5′；GAPDH 上引物：5′-GATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′，下引物：3′-ATGAAGGGGTCGTTGATGG-5′。采用TAKARA 實時熒光定量PCR 試劑盒進行熒光定量PCR 檢測，檢驗引物的溶解曲線，分析各組目的基因的ΔCT值，采用2-ΔΔCT法計算基因表達量。將各腦區腦組織在冰上研磨后提取蛋白并采用BCA 定量。通過Western blot 法檢測IL-1β、IL-6 及TNF-α的蛋白表達。取各組蛋白樣品，經過電泳轉膜和封閉后加入一抗（IL-1β、IL-6 及TNF-α）過夜，洗膜后孵育二抗并顯色，進行定量分析。

1.7 MDA、SOD 和ROS 活性測定參照既往文獻［9］，在低溫下制取額葉皮質和海馬組織勻漿，低溫離心15 min 后取上清。依照試劑盒說明書，分別對丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及活性氧化物（ROS）的表達水平進行測定。

1.8 統計學方法采用SPSS 20.0 統計軟件，研究數據以均數±標準差表示。分析方法采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 法分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丙泊酚減輕膿毒癥所致腦損傷假手術組額葉皮質和海馬CA1 區的細胞未見異常（圖1）。C組大鼠相應腦區神經細胞核固縮，細胞體積縮小，正常神經元數量減少明顯。高、低劑量丙泊酚預處理組異常神經元數量低于C 組，腦組織形態改變明顯減輕，相較于P1 組，P2 組對應腦區的異常改變明顯更小（F皮質= 110.7，P皮質＜0.01；F海馬=105.4，P海馬＜0.01）。實驗結果證明丙泊酚能夠減輕神經細胞損傷，保護腦組織。

圖1 腦組織H&E 染色（×400）Fig.1 H&E staining images of brain（×400）

2.2 丙泊酚改善膿毒癥大鼠的認知功能障礙術前連續訓練中，各組大鼠的平均游泳距離和潛伏期隨著訓練時間的增加逐漸縮短，游泳速度無明顯差異。反轉實驗中，與Sham 組相比，C 組游泳距離和潛伏期明顯增加，在平臺所在象限活動的距離和時間明顯縮短（P＜0.01）；P2 組相較于C 組，其游泳距離和潛伏期則顯著縮短，在平臺所在象限活動的距離和時間明顯縮短（P＜0.01）；每組大鼠的游泳速度無明顯差異，見表1、圖2。

2.3 丙泊酚抑制膿毒癥大鼠的血清及腦組織的炎癥反應相較于Sham 組，C 組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量以及額葉皮質和海馬CA1 區的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA 和蛋白表達顯著增加；與C 組相比，丙泊酚預處理組大鼠的血清和對應腦區的上述炎癥因子表達水平明顯降低（P＜0.05，見表2、圖3）。

表1 水迷宮實驗Tab.1 Morris water maze test ±s

表1 水迷宮實驗Tab.1 Morris water maze test ±s

注：*P ＜0.05，**P ＜0.01 vs. Sham 組；NSP ＞0.05，#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs.C 組

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圖2 水迷宮實驗Fig.2 Morris water maze test

2.4 丙泊酚減輕膿毒癥大鼠腦組織的氧化應激反應相較于Sham 組，C 組、P1 組、P2 組額葉皮質和海馬CA1 區的MDA 和ROS 水平明顯升高，SOD 活性明顯降低（P＜0.01）；與C 組相比，P1 組的上述指標差異無統計學意義（P＞0.05），而P2 組大鼠對應腦區的MDA 和ROS 水平明顯降低，SOD 活性明顯升高（P＜0.05）。見圖4。

表2 炎癥反應Tab.2 Inflammatory response ±s

表2 炎癥反應Tab.2 Inflammatory response ±s

注：Gapdh 為內參，*P ＜0.05，**P ＜0.01 vs.Sham 組；##P ＜0.01 vs.C 組

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圖3 炎癥反應Fig.3 Inflammatory response

圖4 腦組織的氧化應激改變Fig.4 Oxidative stress changes in brain tissue

3 討論

本研究采用大鼠盲腸結扎穿孔復刻膿毒癥模型，探究丙泊酚在膿毒癥所致腦損傷中的腦保護作用。Morris 水迷宮是認知功能評價的經典研究方法［10］，因此本研究選用Morris 水迷宮對實驗大鼠的認知功能進行評估。水迷宮實驗中，術后48 h檢測發現造模組大鼠的游泳距離和潛伏期明顯增長，說明膿毒癥大鼠發生了認知功能障礙，與前人研究一致，證實建模成功［11］。不同劑量丙泊酚預處理后大鼠的游泳距離和潛伏期縮短，加上平臺所在象限的活動結果，說明丙泊酚預處理能有效緩解膿毒癥所致腦損傷。

目前對膿毒癥所致腦認知功能障礙的機制研究發現，膿毒癥造成的炎癥反應、氧化應激與腦組織神經元的損傷密切相關。本研究發現血清及腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達顯著增加，腦組織中MDA、ROS 增加，而SOD 活性下降，證明膿毒癥引起了全身及腦組織炎癥反應和腦組織的氧化應激反應。組織學染色結果也顯示膿毒癥導致大鼠額葉皮質以及海馬CA1 區的損傷神經元明顯增多，表現為細胞核深染呈固縮、碎裂相，與以往實驗結果類似［12-13］。本實驗采用丙泊酚預處理后，腦組織炎癥因子降低、氧化應激反應減輕、損傷神經元數目明顯減少，與丙泊酚改善實驗大鼠認知功能結果一致，證明丙泊酚預處理可減輕血清及腦組織中炎癥反應和氧化應激反應，改善膿毒癥所致的認知功能障礙。

丙泊酚是一種持續泵注無蓄積的靜脈鎮靜藥，其非麻醉效應如抗炎、抗氧化、抗焦慮、減輕惡心嘔吐等作用也受到關注［14-16］。目前許多研究已證實丙泊酚能夠抑制在體或體外的炎癥反應。SOUSA 等［17］發現丙泊酚可以通過改變炎性細胞的趨化和吞噬功能，抑制炎癥因子分泌，調控氧化亞氮水平等方面調控機體的炎癥反應。炎癥反應和氧化應激反應往往伴隨產生，二者相互促進。HALLADIN［18］提出丙泊酚可以通過抑制氧自由基的產生而減輕機體的氧化應激反應，同時還能調節細胞因子的平衡而抑制炎癥反應等機制對多種器官的損傷發揮保護作用。此外，ZHENG 等［19］研究表明，丙泊酚能抑制脂質過氧化以及清除自由基，從而調控下游信號，發揮神經保護作用。本研究結果顯示丙泊酚預處理可減輕膿毒癥大鼠血清和腦組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量，表明丙泊酚具有較強的抗炎作用。同時本研究還發現，丙泊酚能夠明顯減少MDA 的產生，增加SOD 的活性，減少ROS 含量，這說明外源性給予丙泊酚能夠增強機體抗氧化應激的能力，從而發揮腦保護作用［20-22］。

本研究發現膿毒癥導致大鼠認知功能障礙、神經元損傷及神經炎癥反應。參照既往國內外文獻，本研究采用不同劑量的丙泊酚干預，結果表明不同劑量的丙泊酚預處理均能改善膿毒癥所致認知功能障礙。其可能機制為：（1）減少神經炎癥因子產生；（2）抑制中樞的氧化應激反應，但其具體通過哪些信號通路及相關途徑調節炎癥反應尚需要深入研究。后續研究將著重探究膿毒癥對腦損傷的機制，以及丙泊酚在減輕膿毒癥所致認知功能障礙過程中的分子機制和作用靶點。

綜上所述，本研究證實了丙泊酚對膿毒癥所致大鼠認知功能障礙具有防治作用，其機制可能與丙泊酚的抗炎和抗氧化作用相關，具有一定的理論基礎研究價值，為治療膿毒癥腦損傷提供了一種新思路。