循環腫瘤DNA在胰腺癌診治研究進展

賈艷會 杜雙雙 劉樹業

1天津市第三中心醫院檢驗科（天津300170）；2天津市人工細胞重點實驗室（天津300170）；3衛生部人工細胞工程技術研究中心（天津300170）

胰腺癌的發病率和死亡率逐年上升。2019年美國癌癥協會頒布的數據顯示，胰腺癌的5年生存率僅為9%，在美國位列惡性腫瘤死亡率第4［1］。同年，中國國家癌癥中心數據顯示，我國每年有9.5 萬例胰腺癌新發病例，位列我國惡性腫瘤發病率的第10 位；死亡率在男性和女性腫瘤相關死因中分別居于第6位和第7位［2］。由于缺乏完善、規范的胰腺癌早期診斷體系，導致胰腺癌早期診斷率和手術切除率較低，甚至在切除后，約80%的患者會因殘留病變而復發，接受完全切除的患者5年生存率約25%［3］，因此早期診治并準確預測疾病復發對提高預后有重要意義。影像學（CT、MRI 和超聲）、血清糖類抗原19-9（CA19-9）和組織活檢等在胰腺癌的應用中都有一定的局限性，臨床上迫切需要一種簡便、靈敏、準確的技術對腫瘤進行動態監測。

近年來，液體活檢（liquid biopsies）作為一種新興的腫瘤無創診斷技術，在腫瘤的診治及預后中發揮著潛在的優勢。液體活檢技術主要分析體液中的循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、外泌體（exosomes）等腫瘤相關分子，具有操作簡便、快速、非侵入性等優勢。液體活檢技術中的液體除血液（全血、血清或血漿）外，還包括尿液，唾液，腦脊液等，胰液也是檢測胰腺癌的常用液體［4］。液體活檢可以反映腫瘤的基因譜，對推進腫瘤診治的精準化進程具有重要意義。本文就ctDNA 在胰腺癌診治研究進展作一綜述，以期給科研和臨床提供一些參考。

1 ctDNA 及其檢測技術

所有的細胞都可以通過主動分泌或細胞壞死、凋亡的方式釋放DNA 進入循環系統中，這些DNA 統稱為游離DNA（cfDNA）。腫瘤細胞在凋亡和壞死過程中釋放的DNA稱為ctDNA。因此腫瘤患者cfDNA 中包含了正常細胞來源的DNA 片段和腫瘤來源的ctDNA。凋亡cfDNA長度約166 ～200 bp，ctDNA 比凋亡cfDNA 要短［5］，約134 ～144 bp。由于正常血細胞凝固時可釋放DNA 到血清中，因此血漿比血清更適合檢測ctDNA［6］。從抽血到離心分離血漿的時間也很關鍵，必須在1 h 內完成。ctDNA 濃度受腫瘤負荷的影響，正常情況下，血液中的ctDNA 濃度很低，占整個循環DNA 的0.01%左右，當機體有腫瘤發生時，可高達90%以上［7］。良性病變、炎性疾病和組織損傷時ctDNA 濃度也會增加。ctDNA 半衰期較短，為16 min 至數小時，因此能夠反映腫瘤的實時狀態［8］。ctDNA 釋放到循環中后，會立即通過核酸酶的作用和尿液排泄從循環中清除；此外，肝臟和脾臟對其的吸收和巨噬細胞的降解也可影響循環中的清除。這種短半衰期也使早期癌癥中ctDNA 的的檢測變得困難。

ctDNA 的檢測包括濃度檢測和結構（突變、甲基化等）檢測。依據檢測原理主要分為以選擇性擴增法為核心和以測序技術為核心的兩類技術［9］。以選擇性擴增為核心的技術包括熒光定量PCR、微滴式數字PCR（ddPCR）、擴增阻滯突變系統（ARMS-PCR）、高分辨溶解曲線分析技術（HRM）等（表1），這類方法靈敏度較高，但易發生偏向性擴增，且只可檢測已知突變。這些方法在乳腺癌、小細胞肺癌的應用均有報道［10-12］，可以指導癌癥患者選擇靶向藥物，為靶向治療提供臨床診斷依據。但在胰腺癌中尚未開展利用ctDNA 指導靶向治療的相關研究。以測序原理為核心的技術主要包括一代測序的Sanger 測序和二代測序（NGS）（表1）。NGS 在早期腫瘤的篩查和晚期腫瘤的治療是目前臨床應用的主要領域，由于腫瘤的臨床NGS 檢測仍然是一個未成熟的、充滿探索性的領域，現階段還無法標準化，加之臨床應用NGS 測序成本較高，造成NGS 臨床推廣應用困難［13］。

ddPCR 技術和NGS 技術在液體活檢中互為補充：NGS 技術可以發現新的突變，ddPCR 可以對單個突變進行動態分析，二者聯合可以檢測0.001%稀有突變［14］。BRCA1/2、PALB2、CDKN2A、RBM10、ARID1A 等基因突變被證實與家族性胰腺癌發病密切相關［15-16］。《胰腺癌綜合診治指南（2018版）》［17］指出高通量測序技術聯合系統生物學分析對胰腺癌進行分子分型，同時結合動物模型開展藥物敏感性的臨床前研究，將為胰腺癌“個體化診療”提供思路。兩種技術結合將會在醫學、生物學等領域發揮更大的作用。

表1 ctDNA 主要分析技術Tab.1 Main analytical techniques of ctDNA

2 ctDNA 在胰腺癌中的應用

2.1 早期診斷和腫瘤分期早期胰腺癌是指腫瘤直徑≤2 cm，局限于胰腺內，無胰腺外浸潤和淋巴結轉移者。胰腺癌的發生與癌基因和抑癌基因的突變密切相關，如KRAS、TP53、SMAD4、CDKN2A等，以KRAS 突變最常見［23］，該突變在癌變早期即可發生。胰腺導管腺癌（PDAC）是胰腺癌最常見的類型，約90%的PDAC 可檢測到KRAS 突變，但78%的ctDNA 突變不是在原發腫瘤樣本中檢測到的，這是因為早期胰腺癌血液中ctDNA 濃度較低，檢測比較困難；而在腫瘤進展時ctDNA 濃度較高更容易檢測到［24］。

KRAS 突變的ctDNA（KRASmutctDNA）的特異度高達96%，但較低的靈敏度限制了其在胰腺癌無癥狀患者篩查和早期診斷中的應用，因此一些研究常把ctDNA 和蛋白生物標志物聯合用于早期胰腺癌的檢測。COHEN 等［25］研究表明KRASmutctDNA單獨用于檢測早期胰腺癌的靈敏度為30%，而將KRASmutctDNA 與蛋白生物標志物（CA19-9、癌胚抗原、肝細胞生長因子和骨橋蛋白）結合，可使靈敏度提高至64%。

異常甲基化狀態與腫瘤的發生密切相關，精準的分期是腫瘤診治和評估預后的基礎。HENRIKSEN 等［26］研究結果顯示ctDNA 啟動子甲基化在胰腺癌發展和惡化過程中積累和改變，對胰腺癌分期有較大的價值。

雖然KRASmutctDNA 和ctDNA 啟動子甲基化對診斷早期胰腺癌有重要價值，但2019年8月美國預防服務工作組（USPSTF）指出目前還沒有生物標志物被批準用于早期胰腺癌的準確檢測［27］。有研究［28］指出ctDNA 可能是胰腺癌晚期生存預測的較好的生物標志物，但在胰腺癌早期診斷中的價值不如CTC 和腫瘤外泌體。

2.2 療效評估和耐藥監測胰腺癌術后輔助化療可以改善患者生存，因此需要可靠的生物標志物來評估化療方案。CA19-9 和CT 成像評估化療方案有一定的局限性，ctDNA 在監測轉移性胰腺癌化療應答中有潛在作用：當治療失敗時，血漿中可檢測到耐藥胰腺癌細胞的DNA 片段，而失敗的治療又可能會促進基因突變，導致耐藥。CHENG等［29］首次在轉移性胰腺癌患者的ctDNA 中發現了四種（BRCA2、EGFR、KDR 和ERBB2）有臨床意義的基因突變率，其中EGFR 在胰腺癌中過表達提示預后較差；ERBB2 突變與腫瘤進展相關，可在癌細胞亞群中上調。

FOLFIRINOX（奧沙利鉑+伊利替康+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣）療法是晚期PDAC 患者的一線選擇。WEI 等［30］前瞻性納入38 例接受FOLFIRINOX化療的晚期PDAC 患者，發現化療后cfDNA 總濃度的變化與腫瘤負荷有關：在化療應答的受試者中，特定改變基因座的等位基因片段比例下降；而對該化療方案耐藥的患者，ctDNA 突變等位基因片段（mutant allele fraction，MAF）增加。他們不僅提供了治療前ctDNA 水平與PDAC 腫瘤負荷相關的證據，也證實了連續的cfDNA 分析是監測化療應答的有力工具。

Eryaspase（L-天冬酰氨酶包埋于紅細胞）是近年來發現的一種新的治療方法，聯合吉西他濱或FOLFOX（奧沙利鉑+亞葉酸鈣+氟尿嘧啶）可作為轉移性胰腺癌的二線治療方案。BACHET 等［31］前瞻性搜集晚期胰腺癌患者治療前、后的血漿，評估ctDNA 對Eryaspase 治療胰腺癌預測和預后的價值，最后得出結論：ctDNA 的基線水平是無進展生存期（progression free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）的一個獨立的預后因素；ctDNA 水平的早期變化與治療效果有關，因此ctDNA可以做為評估Eryaspase 對晚期胰腺癌患者療效的生物標志物。

除化療外，胰腺癌治療還包括免疫治療和不可逆性電穿孔等方法，ctDNA 在這些治療中的應用也有報道［32-33］，不過目前多在臨床試驗階段。ctDNA 可用于監測治療的應答和耐藥性，并能比組織活檢更好地捕獲腫瘤異質性，因此化療過程中ctDNA 可能是早期治療效果的預測性生物標志物。

2.3 識別術后MRD、預測復發及評估生存期PDAC 術后較高的復發率是PDAC 高死亡率的原因之一。常規術后監測方法包括臨床癥狀、CA19-9 等腫瘤標志物和CT 成像對微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）缺乏敏感性和特異性，因此迫切需要一種可靠的方法來識別MRD 并預測復發風險。研究表明ctDNA 可以識別MRD，對預測腫瘤復發具有較高的敏感性。SAUSEN 等［34］應用ddPCR 技術檢測早期胰腺癌患者血漿發現：術后檢出ctDNA 的患者比未檢出ctDNA 的患者更易復發；ctDNA 預測復發的平均時間為3.1 個月，而CT確定復發的平均時間為9.9 個月，因此胰腺癌患者術后血漿ctDNA 可以較早預測外科術后是否有病灶殘留或疾病復發。GROOT 等［35］不僅有相同的結論，還評估了ctDNA 預測PDAC 術后復發的準確性，準確率為89%，他們的研究證實ctDNA 檢測是PDAC 術后復發的準確預測因子。

JIANG 等［36］分析PDAC 患者術前及術后血漿ctDNA，結果發現ctDNA 檢出率隨PDAC 分期的增加而增加；ctDNA 的最大變異等位基因分數（variant allelic fraction，VAF）與腫瘤最大直徑正相關；術后ctDNA 陽性是無病生存期（disease free survival，DFS）的獨立因素。因此術后監測ctDNA 可以識別MRD，從而預測復發的風險。PIETRASZ 等［37］研究結果表明ctDNA 與DFS 和OS 負相關，是晚期胰腺癌患者一個獨立的預后生物標志物。HADANO等［38］有類似的發現。但他們只證實了ctDNA 陽性提示預后不良，均未分析術后及治療后ctDNA 濃度變化。BETTEGOWDA 等［39］則進行了ctDNA 濃度方面的相關研究，結果表明生存率隨ctDNA 濃度的增加而下降。因此動態監測ctDNA 濃度可以盡早區分疾病穩定和病情進展，評估預后。

綜上，檢測胰腺癌患者術前和術后血漿ctDNA 有非常重要的意義：如果胰腺癌患者術前的血漿中檢測到ctDNA，則可選擇術前化療而避免不必要的開腹手術；若胰腺癌患者術后血漿中未檢測到ctDNA，則需考慮更強的輔助治療方案，這既有助于對高危患者提供充分的輔助治療，又可避免對低危患者的過度治療［40］。

3 總結與展望

精準的個體化治療是癌癥治療的新目標。在個體化理念下，胰腺癌的精準治療需要全面評估患者個體差異如伴隨的基礎疾病，以及腫瘤個體差異如大小、數目、播散轉移及血管浸潤等情況，以實現治療的精準化，提高患者生活質量。ctDNA代表了腫瘤細胞的基因組信息，可以反映患者整體疾病的基因組狀態，為精準醫療和制定胰腺癌個體化治療方案提供了一新的參考模式。然而迄今為止，經FDA 批準的ctDNA 檢測只可用于轉移性和局部進展期非小細胞肺癌（NSCLC）及晚期乳腺癌等極少數癌癥［41］。要實現ctDNA 對早期腫瘤尤其是早期胰腺癌的篩查和診治還面臨一些挑戰，具體如下：（1）ctDNA 檢測缺乏標準化的技術規范：2019 國家衛生健康委臨床檢驗中心開展的ctDNA 室間質評共計173 個假陽性、67 個假陰性突變結果，因此ctDNA 檢測質量仍有待提高［42］。（2）缺乏高靈敏度的檢測方法：胰腺癌早期（Ⅰ期、Ⅱ期）ctDNA 檢出率不超過30%［43］；2019 國家衛生健康委臨床檢驗中心開展的ctDNA 室間質評中，cfDNA 平均提取效率僅為41.5%，因此亟需高靈敏度的檢測方法［42］。（3）目前可嘗試用于治療胰腺癌的分子靶點不多，加之胰腺癌具有較強的腫瘤異質性和功能復雜的間質成分，其基于基因測序進行精準治療的難度更大［44］。如何從血液中分離足量、高質量的cfDNA，并將ctDNA 從正常的cfDNA中區分出來，這是研究ctDNA 的關鍵。臨床需要建立指導方針和標準操作程序，積極開展臨床多中心研究，從而使ctDNA 成為腫瘤精準治療一個強大的科研和臨床工具。