p-ERK下調分揀蛋白表達對非酒精性脂肪肝大鼠肝損傷的機制研究*

藺文燕，田利民，狄寶山，余 靜，牛想娥，張 琦△，劉 靜△

（1甘肅省人民醫院內分泌科，2甘肅省人民醫院西院區，甘肅蘭州 730000）

隨著肥胖和糖尿病發病率的增加，非酒精性脂肪性肝病（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）成為威脅人類健康最常見的慢性肝病之一，也是21 世紀全球重要的公共健康問題之一［1-2］。研究統計，亞洲普通人群中NAFLD 的患病率為25%［3］，在肥胖人群中為57.5%～74.0%，約15%～50%的肝纖維化和肝硬化與NAFLD 有關［4］，脂肪肝纖維化患者中約30%于10 年后可發展為肝硬化，進一步導致肝癌［5-7］。以往的研究多集中在NAFLD 的血清學及藥物方面，而NAFLD 的發病機制研究較少。因此，體外成功構建NAFLD 的動物模型對于研究疾病的發生、發展及防治十分重要［5］。

肝竇內皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）功能紊亂是NAFLD 形成的早期階段［8-10］。分揀蛋白（sortilin）由SORT1基因編碼［11-12］，屬于Vps10P 域受體家族一員，廣泛分布于腦、肝、脂肪和神經等組織及相關細胞，參與多種蛋白的胞內外分泌與轉運、細胞凋亡和生存及信號轉導等［13-14］。全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）運用無偏倚的工具研究表明，sortilin 與低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的降低密切相關［15-16］，但對以甘油三酯（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高為特征的脂質代謝紊亂的NAFLD［17-19］的相關報道尚少。本研究結合動物和細胞實驗，探討磷酸化細胞外信號調節激酶（phosphorylated extracel?lular signal-regulated kinase，p-ERK）下調sortilin 表達與NAFLD肝損傷形成的機制，為NAFLD的防治提供實驗依據。

材料和方法

1 實驗動物

40 只8 周齡雄性的SPF 級Wistar 大鼠（180～220 g），由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供［生產許可證號為SCXK（甘）2019-0002，動物倫理批準號為syll20160031］，實驗室適應性喂養1 周，大鼠自由進水，標準飼料喂養。

2 主要試劑

油紅O（oil red O，ORO）染色試劑盒（細胞專用）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipo?protein，ox-LDL）和基底膜六胺銀染色試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供；內皮細胞生長因子（endo?thelial cell growth factor，ECGF）由不倫瑞克公司提供；膠原酶Ⅱ由Sigma提供；兔抗sortilin抗體、兔抗p-ERK 抗體、兔抗CD31 和β-actin 抗體由Abcam 提供；PD98059由Selleck提供；引物由TaKaRa合成；Annex?inⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒由BD提供；ELISA 試劑盒由上海卒瑞生物科技有限公司提供；DAB 顯色試劑盒購于北京中杉金橋有限公司提供。

3 主要儀器

YD-315 切片機、YD-AB 生物組織攤烤片機和YD-6L 生物組織冷凍包埋機（金華市益迪醫療設備有限公司）；熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS）；凝膠圖像分析系統和實時熒光定量PCR 儀（BIO-RAD）；酶標儀（TECAN）；流式細胞儀（Becton Dickinson）。

4 動物實驗方法

4.1 NAFLD 大鼠模型的建立 40 只大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為對照（control）組（n=10）、高脂飲食（high-fat diet，HFD）組（n=10）、PD98059 組（n=10）和HFD+PD98059 組（n=10）。本課題組前期研究表明高脂飼料（基礎飼料73.6%，豬油15%，膽固醇1.2%，膽酸鈉0.2%和蛋黃粉10%）喂養可成功建立NAFLD 大鼠模型［20］，因此本研究采用高脂飼料喂養建立NAFLD 大鼠模型。同時，PD98059 組和HFD+PD98059 組給予腹腔注射PD98059（10 mg/kg），con?trol 組及HFD 組給予腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液［21］。

4.2 標本處理和指標檢測 干預6 周后，禁食不禁水12 h，次日上午稱重、麻醉、摘眼球取血，并迅速取出肝臟，用預冷的生理鹽水清洗肝臟表面，稱取肝臟濕重，按常規制備血清和肝組織石蠟切片備用。血清脂質指標［總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholester?ol，HDL-C）和LDL-C］及肝功能指標［丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）］按照試劑盒說明方法檢測；血清白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）用ELISA 法檢測；肝組織石蠟切片用于HE 染色和免疫組化；六胺銀染色按照試劑盒說明方法檢測。肝臟指數（%）=肝臟濕重（g）/體重（g）×100%。

5 細胞實驗方法

5.1 原代LSECs 的提取、培養及鑒定 按照參考文獻［22-25］及本課題組前期研究［26］的方法提取大鼠的LSECs。將LSECs 培養于含有內皮細胞生長因子（endothelial cell growth factor，ECGF）的低糖型完全培養液中，把細胞放進CO2培養箱中培養（培養參數：潮濕的空氣，5% CO2，37℃），根據細胞形態、融合度及培養液顏色換液傳代。細胞隨機分為對照（con?trol）組、ox-LDL（100 mg/L）組、PD98059（10 μmol/L）組和ox-LDL+PD98059（100 mg/L ox-LDL+10 μmol/L PD98059）組進行后續實驗。Anti-CD31 免疫熒光染色鑒定LSECs。

5.2 細胞免疫熒光實驗 將細胞按1×107/L 的密度接種至含有蓋玻片的6 孔板上，待細胞鋪滿蓋玻片時，將蓋玻片放入100 mm的細胞培養皿中，用預冷的PBS 浸洗3 次，4%的多聚甲醛固定爬片20 min，PBS浸洗3 次，預冷的0.2% Triton X-100 室溫通透10 min，PBS浸洗3次，在爬片上滴加山羊血清，室溫封閉1 h，棄封閉液，每張玻片加入適量的Anti-CD31 抗體（1∶500）并放入濕盒，4℃孵育過夜；次日取出濕盒中的爬片，PBS 清洗3 次，滴加熒光Ⅱ抗（Anti-FITC，1∶300），濕盒孵育2 h，PBS 清洗3 次，暗處滴加DAPI 避光孵育5 min染核，PBS清洗4次，用抗熒光淬滅劑的封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下采集圖像。

5.3 ORO 染色和LSECs 凋亡的檢測 ORO 染色和流式細胞術根據ORO 染色（細胞專用）試劑盒和An?nexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的方法進行操作。

5.4 RT-qPCR 和Western blot 實驗 RT-qPCR 檢測時分別根據總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒說明書進行RNA提取、逆轉錄和擴增，檢測各組細胞RNA 的表達；Western blot 檢測時依次按照提取蛋白、蛋白濃度測定、配制凝膠、電泳、轉膜、封閉、免疫反應和化學發光的步驟進行。RT-qPCR 引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

6 統計學處理

實驗結果用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，以均數±標準差（mean±SD）的形式表示。單因素方差分析用于多組間比較。以P＜0.05表示差異有統計學意義。每次實驗至少重復進行3次。

結果

1 高脂喂養對大鼠體重、血脂、肝功能和肝臟指數的影響

干預6 周后，與control 組相比，HFD 組和HFD+PD98059 組大鼠體重升高（P＜0.05），血清TC、TG、LDL-C、AST 和ALT 水平升高（P＜0.05），HDL-C 水平降低（P＜0.05），肝臟指數升高（P＜0.05），PD98059組上述各指標無顯著變化（P＞0.05）；與HFD 組相比，PD98059 組和HFD+PD98059 組大鼠體重降低（P＜0.05），血清TC、TG、LDL-C、AST和ALT水平降低（P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05），肝臟指數降低（P＜0.05）；與PD98059 組相比，HFD+PD98059 組大鼠體重升高（P＜0.05），血清TC、TG、LDL-C、AST和ALT水平升高（P＜0.05），HDL-C水平降低（P＜0.05），肝臟指數升高（P＜0.05），見表2。

表2 大鼠體重、血脂、肝功能和肝臟指數的比較Table 2.Comparison of body weight，blood lipids，liver function and liver index in rats（Mean±SD. n=10）

2 大鼠血清炎癥因子IL-6和TNF-α表達的變化

與control 組相比，HFD 組和HFD+PD98059 組IL-6 和TNF-α 表達水平升高（P＜0.05），PD98059 組無顯著變化（P＞0.05）；與HFD組相比，PD98059組和HFD+PD98059 組IL-6 和TNF-α 表達水平降低（P＜0.05）；與PD98059 組相比，HFD+PD98059 組IL-6 和TNF-α表達水平升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.The serum levels of IL-6 and TNF-α in rats.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HFD group；△P＜0.05 vs PD98059 group.圖1 大鼠血清IL-6和TNF-α水平的變化

3 大鼠肝組織病理形態學的變化

HE 染色表明，control 組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞結構清晰，圍繞中央靜脈呈放射狀排列分布，細胞內無脂滴形成，細胞核位于細胞中央，細胞質均勻，無脂肪變性；HFD 組大鼠肝小葉排列松散、紊亂，肝細胞內可見大小不等的氣球樣脂肪空泡，呈現顯著的脂肪變性，胞質內充滿脂滴，炎癥細胞彌散浸潤在脂肪樣變肝組織中；PD98059 組肝小葉結構清晰，無脂滴、脂肪變性和炎癥細胞浸潤；HFD+PD98059組較高脂組有略少的脂滴形成和炎癥細胞浸潤，脂肪變性減少，細胞內可見少許脂滴。免疫組化染色表明，與control 組相比，HFD 組p-ERK 蛋白水平升高，PD98059 組和HFD+PD98059 組p-ERK 蛋白水平降低，而HFD組和HFD+PD98059組sortilin蛋白水平降低，PD98059 組sortilin 蛋白水平無顯著變化；與HFD 組相比，PD98059 組和HFD+PD98059 組p-ERK蛋白水平降低，sortilin 蛋白水平升高；與PD98059 組相比，HFD+PD98059 組p-ERK 蛋白水平無顯著變化，sortilin 蛋白水平降低。六胺銀染色表明，control組肝組織結構完整，肝組織連續的網狀結構與肝索平行；HFD 組肝竇基底膜和竇間隙增厚，可見大片銀顆粒沉積和肝細胞脂肪變性；PD98059 組肝組織結構與control 組無顯著變化；HFD+PD98059 組肝竇基底膜有銀顆粒沉積，肝細胞脂肪變性程度較高脂組減輕。見圖2。

4 LSECs的培養和鑒定

LSECs 從control 組大鼠肝臟分離出來，倒置相差顯微鏡下觀察：細胞邊緣清晰，胞核位于中央，形態飽滿，似多邊形或梭形，大小均勻呈“鵝卵石”樣生長，細胞間緊密靠攏，見圖3A。Anti-CD31 免疫熒光染色表明，90%的細胞免疫熒光染色陽性，DAPI 染核藍色，表明CD31表達于LSECs上，見圖3B。

5 ORO染色和流式細胞術結果

ORO 染色表明，control 組LSECs 內有少量的脂滴，表明細胞間脂滴含量低；ox-LDL 組LSECs 內可看到大量紅色脂滴；PD98059 組LSECs 內有極少量脂滴；ox-LDL+PD98059 組LSECs 脂滴較ox-LDL 組減少。流式細胞術結果顯示，control 組細胞的凋亡率為6.65%；ox-LDL 組細胞的凋亡率為12.14%，較control 組顯著升高（P＜0.05）；PD98059 組細胞的凋亡率為3.41%，ox-LDL+PD98059 組細胞的凋亡率為10.83%，均較ox-LDL 組顯著降低（P＜0.05），見圖4。

6 LSECs中sortilin和p-ERK的表達水平

Figure 2.Pathomorphological changes of rat livers（scale bar=50 μm）.A：control group；B：HFD group；C：PD98059 group；D：HFD+PD98059 group.圖2 大鼠肝組織病理形態學的變化

Figure 3.Morphological changes（A）and CD31 expression（B）in the LSECs observed under fluorescence microscope（scale bar=20 μm）.圖3 熒光顯微鏡下LSECs的形態和CD31的表達

Western blot 和RT-qPCR 結果顯示，與control 組相比，ox-LDL 組p-ERK 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），PD98059 組和ox-LDL+PD98059 組p-ERK 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），sortilin 蛋白和mRNA 水平亦顯著降低（P＜0.05），而PD98059 組sortilin 蛋白及mRNA 水平無顯著變化（P＞0.05）；與ox-LDL 組相比，PD98059 組和ox-LDL+PD98059 組p-ERK 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），而sortilin 蛋白和mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與PD98059 組相比，ox-LDL+PD98059 組p-ERK 蛋白水平無顯著變化（P＞0.05），sortilin 蛋白及mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

討論

NAFLD是以肝臟脂肪變性和脂肪蓄積為特征的脂質代謝紊亂性疾病，炎癥反應和細胞凋亡等因素在其中發揮重要作用［27］。高脂飼料喂養的動物模型是目前常用的NAFLD動物模型，它模擬了NAFLD的發生發展和病變特征［5，20］。LDL 是一種運載膽固醇進入外周組織細胞的脂蛋白顆粒，當其被氧化成為ox-LDL 時可引起血管硬化和NAFLD 等相關疾病［28］。LDL-C 是反映全身的脂代謝狀態的標志之一，血管內積聚的LDL-C 一旦超過了肝臟存儲的極限能力，將會產生毒性作用，導致肝損傷和功能障礙［28］。AST和ALT 是分布在肝細胞內最常用的評估肝功能和肝損傷的指標，其升高程度與肝細胞受損程度一致。如果肝臟發生損傷，肝細胞中的轉氨酶便進入血液，血液中AST 和ALT 水平升高，是肝臟疾病提示信號［29］。本實驗中高脂模型大鼠血清AST 和ALT 水平升高，PD98059干預后，其水平降低。

目前“二次打擊”學說是NAFLD 的機制假說之一，其認為脂質在肝細胞的聚集（第1 次打擊）后觸發一系列細胞毒素反應（第2 次打擊），導致肝損傷是NAFLD 的重要機制［30-31］，因此脂質代謝的調控是預防和逆轉NAFLD 發生、發展的有效手段，尤其是降低血清LDL-C。本研究表明，PD98059 干預后，能夠顯著降低NAFLD 模型大鼠TC、TG 和LDL-C 水平，同時升高HDL-C 水平，提示PD98059 能夠通過減輕“第1次打擊”預防及逆轉NAFLD 的發生。本研究還發現，PD98059 干預后，大鼠肝臟組織sortilin 蛋白及mRNA SORT1 的表達上調，同時IL-6 和TNF-α 的表達顯著下調，說明此干預抑制炎癥因子釋放的同時能夠顯著上調肝臟組織sortilin 蛋白及mRNA 的表達，為減輕NAFLD“第2次打擊”提供了客觀依據。

Figure 4.Oil red O（ORO）staining（scale bar=20 μm）and determination of apoptosis rate in LSECs by flow cytometry.A：control group；B：ox-LDL group；C：PD98059 group；D：ox-LDL+PD98059 group.圖4 油紅O染色和流式細胞術測定LSECs凋亡率

Figure 5.The expression of sortilin and the protein level of p-ERK detected by Western blot and RT-qPCR.A：the protein levels of sortilin and p-ERK detected by Western blot；B：the mRNA expression of sortilin detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；△P＜0.05 vs PD98059 group.圖5 Western blot和RT-qPCR檢測sortilin表達及p-ERK蛋白水平

sortilin 是體內調控脂質轉錄與合成的關鍵因子，作為LDL 的細胞表面清除受體，其通過與載脂蛋白ApoB 的結合調控LDL 分泌，并將其導向細胞表面分泌或降解［32-34］，從而參與脂質顆粒的形成及轉運過程［15-16］。ERK 是將信號從表面受體傳至細胞核的關鍵細胞外調節蛋白激酶［35］，可接受上游的級聯反應信號刺激（如ox-LDL）轉化為p-ERK 進入細胞核，活化細胞核內的某些轉錄因子，進而參與細胞的調控及增殖等［36-37］。在本實驗中，高脂條件下sortilin表達下調，p-ERK 表達上調，PD98059 抑制p-ERK 后，sor?tilin 表達上調，p-ERK 表達下調，PD98059 可以逆轉sortilin 的表達，且sortilin 的mRNA 表達水平呈同等趨勢改變，提示ERK 信號通路的激活可能是sortilin調節NAFLD 形成的途徑之一，PD98059 通過ERK 信號轉導抑制高脂血癥小鼠的肝脂肪形成和脂肪變性。因此抑制肝臟內p-ERK 的活性（PD98059），上調sortilin 的表達，可能促進脂質代謝，預防NAFLD的形成和炎癥反應。血漿中增加的ox-LDL 被認為是脂積累和LSECs 凋亡的誘導劑［38-39］，本實驗中，高脂條件下，LSECs 的凋亡增加，PD98059 干預后，LSECs 的凋亡降低，提示高脂在引起細胞凋亡過程中有重要作用。

綜上所述，ox-LDL 激活p-ERK 信號通路下調肝組織sortilin 的表達，PD98059 干預后，sortilin 表達上調且p-ERK、TNF-α 和IL-6 表達下調，同時大鼠肝臟損傷、脂質蓄積、脂肪變性、炎癥反應和細胞凋亡得到顯著改善，其機制可能與sortilin 增強肝功能和降低脂質氧化水平帶來的毒性反應有關。