具有煙草根結線蟲防效的萬壽菊秸稈生物有機肥配方及田間防控研究

劉加紅 盤文政 呂亞瓊

摘要：根結線蟲病是一種重要的煙草土傳病害，在局部煙區發生嚴重，造成過巨大經濟損失。采集受根結線蟲危害的植煙區土壤，分離出線蟲后，利用已有菌種庫資源，通過室內菌株發酵液滅殺線蟲活性試驗，篩選出了4株具有防治根結線蟲的生防菌株，菌株發酵液原液室內殺線效果良好，均達到80%以上，隨著稀釋倍數增加滅殺活性不斷降低，320倍時滅殺活性完全喪失。將篩選出的功能菌與腐熟的萬壽菊秸稈有機肥復配后形成功能型生物有機肥，在植煙區通過田間小區試驗驗證其功能，結果表明，施用功能型生物有機肥后，能夠促進煙株的早生快發，在后期能夠促進葉片開片，改善烤煙農藝性狀，但根結線蟲危害情況并無改善，說明在根結線蟲危害極為嚴重的地塊，生防功能有機肥對根結線蟲的防治效果有限。

關鍵詞：煙草;根結線蟲;生防菌株;萬壽菊秸稈;農藝性狀

煙草（Nicotiana tabacum L.）是茄科煙草屬，一年生或有限多年生草本植物，原產于南美洲。目前在我國云南、貴州等地大面積種植，是我國重要的經濟作物之一，其成熟葉片主要用于卷煙生產，具有極高的經濟價值。因此在烤煙生產過程中，提高煙葉產量和品質極為重要，而煙草病害是影響煙葉產量和品質的重要因素[1-3]。

其中，根結線蟲病是煙草種植的主要病害之一，嚴重影響煙草的高質高產[4-5]，在我國各大煙草種植區均有發生，且危害嚴重，每年因根結線蟲危害造成的損失巨大。據統計，全國根結線蟲直接危害所造成的煙葉經濟損失占侵染性病害造成損失的5.7%[6]，嚴重制約煙葉的生產發展。但是由于該病侵染的特殊性、為害的隱蔽性而對防治工作造成了極大的困擾[7]。并且受環境和經濟水平所限，我國大部分缺水旱作煙區無法開展水旱輪作，因此多采用化學手段防治[8-10]，雖取得了一些成效，但因其選擇性差、高殘留和不易降解，也造成了煙葉農藥殘留增加、農作物生態環境被破壞、煙葉品質下降、環境污染加重、抗藥性問題日益突出等后果[11-13]。

隨著國家煙草專賣局提倡綠色防控理念，減少化學農藥使用，采用微生物菌劑或其他綠色防控措施替代化學農藥，已經成為煙草病蟲害防控的主要思路。因此，篩選出具有生防功能的微生物，將其應用到煙草生產中，并評價其針對煙草根結線蟲的防控效果，對煙草根結線蟲的防控、生態環境的保護以及人們生命健康具有重大意義[14]。

萬壽菊別稱臭芙蓉，一年生草本花卉，其花朵提取的色素被廣泛用于食品、化妝品、煙草、醫藥及禽類飼料中[15-17]。由于其用途廣泛以及具備的經濟價值，在曲靖地區大面積種植。萬壽菊主要經濟器官是花朵，采收后會產生大量秸稈，但由于萬壽菊秸稈中木質素、纖維素的含量較高，直接還田難以自然降解，而且含有多種揮發性化學成分，不能作為飼料使用。目前萬壽菊秸稈大部分就地焚燒或曬干后作農家燃料，均未能得到有效利用，造成了資源的極大浪費，且對環境造成一定污染[18]。國內多個學者均針對此問題進行研究，并且有研究表明，萬壽菊秸稈提取物對根結線蟲具有較好的抑殺作用[19]。

本研究第1階段利用已有菌種庫資源，篩選能夠防治煙草根結線蟲的生防菌株，探究其對煙草根結線蟲的滅殺效果，同時研究具有殺線潛力菌株與完全腐熟萬壽菊秸稈有機肥的復配機制。第2階段采用田間小區試驗的方式，開展以萬壽菊秸稈為原料開發的生防功能有機肥對烤煙生產和線蟲危害的影響研究，通過對施肥前后植煙土壤養分、煙株的田間長勢長相和農藝性狀、線蟲的發生狀況、經濟性狀和煙葉品質等數據的綜合分析，客觀評價生防功能有機肥在曲靖煙區的應用效果，整個研究對曲靖植煙區煙草根結線蟲及土壤保育具有重要意義，并且為后期的推廣應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為云南省微生物發酵工程研究中心有限公司自主篩選研發的具有殺線作用的生防菌株。

供試根結線蟲采自曲靖市沾益區大坡鄉植煙區受根結線蟲侵染的煙株，煙草品種為云煙97，取受侵染煙株根際土，采用蔗糖離心浮選法分離根結線蟲。

供試地為曲靖市沾益區大坡鄉。試驗時間為2019年5—12月。供試作物為煙草品種（云煙97）。

供試肥料：煙草專用復合肥（氮、P2O5、K2O含量分別為15%、8%、25%）、普通過磷酸鈣（P2O5含量≥17%）、硝酸鉀（氮、P2O5、K2O含量分別為135%、0%、44.5%）、硫酸鉀（K2O含量≥50%）、鈣鎂磷肥（P2O5含量≥18%）、生防功能有機肥5號（萬壽菊秸稈有機肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ5），生防功能有機肥9號（萬壽菊秸稈有機肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ9）、生防功能有機肥11號（萬壽菊秸稈有機肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ11）、生防功能有機肥12號（萬壽菊秸稈有機肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ12）。

蔗糖溶液的配制：1 000 mL純凈水+454 g蔗糖（白糖）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蔗糖離心懸浮法分離根結線蟲 按李美芹等的專利中提及的蔗糖離心懸浮法進行根結線蟲的分離[20]。分離完成后，取試管下部帶有線蟲的液體，取1 mL置于培養皿中，于體式顯微鏡下計數。

1.2.2 具有拮抗煙草根結線蟲的功能菌株篩選

1.2.2.1 不同生防菌株對根結線蟲滅殺活性測定 將菌種庫保存的具有殺線功能的菌株分別接種于Luria-Bertani（LB）液體培養基中進行活化，即37 ℃、180 r/min 培養48 h，后將菌液濃度稀釋至 1億CFU/mL，取1 mL置于48孔細胞培養板中，再加入線蟲懸浮液100 μL（約 100頭）混勻，25 ℃靜置12 h后，于光學顯微鏡下觀察，記錄線蟲存活情況，計算校正死亡率（僵直不動為死體，彎曲蠕動為活體）。設無菌LB液體培養基及萬壽菊秸稈有機肥浸出液處理作為對照，每個處理設置5個重復。

根據以下公式計算線蟲的校正致死率：致死率=死亡線蟲數/供試線蟲數×100%;

校正致死率=（處理致死率-對照致死率）/（1-對照致死率）×100%。

選取上述試驗中對線蟲校正死亡率在80%以上的菌株分別進行處理時間及處理濃度的測定，即利用其發酵原液分別處理線蟲30、60、90、120、150、180 min;利用其發酵原液以及10、20、40、80、160、320、640倍的稀釋液分別處理線蟲，觀察記錄線蟲的活性情況，計算校正死亡率，每個處理設置5次重復。

1.2.2.2 不同生防菌株在溫室大棚內對根結線蟲防效的測定 試驗于云南省微生物發酵工程研究中心有限公司試驗基地溫室大棚內進行，將健康且長勢一致的煙苗移栽至裝有從受危害嚴重地區（曲靖市沾益區大坡鄉）采集的根際土壤的花盆中，制備供試菌株發酵液，在煙苗移栽后3 d，每盆分別灌根300 mL，同時設清水、LB液體培養基、萬壽菊秸稈有機肥浸出液3個處理作為對照。90 d后取煙株根系調查病情指數，分級并記錄結果，調查方法采用GB/T 23222—2008 《煙草病蟲害分級及調查方法》。

1.2.3 功能微生物與完全腐熟的萬壽菊秸稈有機肥復配 利用能夠防治煙草青枯病的生防菌1號（Q1）、能夠防治煙草黑脛病的生防菌2號（Q2）與上述試驗中防效較好的菌株分別復配后添加到完全腐熟的萬壽菊秸稈有機肥中，添加量為肥料總質量的1%，添加結束后按倉庫正常堆貯條件堆放，定期檢測各生防功能菌的有效活菌數，同時每天定時檢測堆體上、中、下層的溫度，連續檢測10 d，并記錄分析。

1.2.4 植煙地區田間效果驗證 試驗安排在曲靖市沾益區大坡鄉，試驗地塊往年發病較為嚴重，試驗前對土壤中線蟲的蟲口密度進行了統計，得出土壤中線蟲的蟲口密度為56頭/100 g。

1.2.4.1 試驗設計 試驗采用隨機區組設計，6個處理，3次重復，共18個小區。

處理1：空白對照，不施用任何有機肥料;處理2：施用萬壽菊秸稈有機肥200 g/株;處理3：施用生防功能有機肥5號200 g/株;處理4：施用生防功能有機肥9號200 g/株;處理5：施用生防功能有機肥11號200 g/株;處理6：施用生防功能有機肥12號200 g/株。

每個小區植煙60株，株行距為120 cm×60 cm，植煙13 890株/hm2。每個處理施純氮97.5 kg/hm2，氮、磷、鉀質量比為1 ∶ 1.5 ∶ 3，各處理肥料具體用量詳見表1。

施肥方法：煙草專用復合肥、普鈣、硫酸鉀、萬壽菊秸稈有機肥和生防功能有機肥作基肥，其中萬壽菊秸稈有機肥和生防功能有機肥在移栽前塘施，煙草專用復合肥、普鈣和硫酸鉀在移栽時中層環施;硝酸鉀作追肥，在移栽后30 d左右兌水澆施。

植煙株數按13 890株/hm2計，單株肥料用量見表2。

1.2.4.2 土壤養分調查 在施肥前取一個基礎土樣，烤煙采烤后每個處理各取1個土樣，合計7個土樣（每個土樣1 kg），對每個樣品的土壤pH值、有機質、全氮、全磷、全鉀、水解性氮、有效磷、速效鉀的含量進行檢測分析。

1.2.4.3 生育期調查 分別觀察記錄每個處理50%煙株達到團棵、旺長、現蕾、封頂、采烤等生育期的時間。

1.2.4.4 農藝性狀調查 在移栽后50 d和采烤前，每個小區試驗選擇5株有代表性的煙株測量其株高、莖圍、葉片數、最大葉長和最大葉寬等農藝性狀。

1.2.4.5 病害發生情況調查 在整個大田生育期對其他主要病害的發生情況以及采烤后取根系調查各處理根結線蟲的發生情況及病情指數進行調查分級并記錄結果，調查方法采用GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》。

1.2.4.6 產質量調查統計 每個處理單獨掛牌烘烤，依據GB 2635—1992《烤煙》中42級國家烤煙分級標準分級，并統計產量和產值。各處理分別選取X2F、C3F、B2F（X2F表示下部葉橘黃色2級煙、C3F表示中部葉橘黃色3級煙、B2F表示上部葉橘黃色2級煙）各1 kg統一送檢，進行煙葉內在化學成分分析。

2 結果與分析

2.1 具有拮抗煙草根結線蟲的菌株篩選

2.1.1 具有滅殺根結線蟲的功能生防菌篩選 由表3可知，利用試驗前期篩選得到的對線蟲具有滅殺活性的7株生防菌再次進行煙草根結線蟲滅殺活性的篩選發現，各菌株發酵液均有滅殺活性，其中5、9、11、12號菌對線蟲的校正致死率都在80%以上，分別達81.12%、84.28%、85.91%、82.36%，后續試驗將選取以上4個菌株進一步開展。

2.1.2 不同稀釋倍數發酵液對線蟲活性的影響 由圖1可知，不同稀釋倍數發酵液對根結線蟲的校正死亡率隨著發酵倍數的增加而降低。稀釋40倍后，各生防功能菌的抑殺活性大幅降低，稀釋160倍后，生防菌的校正致死率均低于10%，稀釋320倍后，各生防菌已基本喪失抑殺活性。

2.1.3 不同處理時間發酵液對線蟲活性的影響 由圖2可知，隨著各菌株發酵液對線蟲的處理時間增長，對線蟲的抑殺活性越強，處理時間為2 h時，9號、11號菌株發酵液校正死亡率大幅高于5號、12號菌株發酵液，且較為相近，分別為81.69%和8159%;處理時間為3 h時，9號、11號菌株發酵液依然極為相近，且均高于其余2株菌株發酵液。整體而言，9號與11號菌株發酵液對線蟲抑殺活性較高，且2 h后隨著時間的延長抑殺活性增幅較小。

2.1.4 不同生防菌株對根結線蟲溫室煙草盆栽防效的測定 由表4的生防結果可知，4株生防功能能菌對煙草根結線蟲均具有一定的防效，生防功能菌的病情指數均低于對照，生防效果依次為WSWFJ11>WSWFJ5>WSWFJ12>WSWFJ9，但本試驗的結果相較于圖1、圖2的結果而言，并未呈現出一致性。

2.2 功能功能微生物與腐熟萬壽菊秸稈復配

由表5可知，功能微生物與萬壽菊秸稈有機肥復配后，功能微生物有效活菌數雖呈下降趨勢，但參照NY 884—2012《生物有機肥執行標準》中有效活菌數≥0.2億CFU/g的要求，該肥料遠超生物有機肥標準。生防功能微生物加入時采用的是離心孢子液的形式，其加入的初始量均大于2.0億CFU/g，由于功能菌種均為芽孢桿菌，加之其存活形態均為芽孢，故其可在有機肥中長久存活，且保持活性。各處理中有效活菌數在180 d內均出現下降現象，但其有效活菌數均維持在1.2億CFU/g以上。

2.3 植煙地區田間效果驗證

2.3.1 生防功能有機肥對烤煙大田生育期的影響 由表6可知，不同處理的大田生育期從移栽至封頂的時間基本一致，說明施用生防功能有機肥對烤煙前、中期的生育期影響不大，也可能是由于試驗區域前期降水量過低，導致煙株生長緩慢，未出現生育期差異，后期由于根結線蟲危害較為嚴重，已失去采烤價值，因此煙葉的成熟期未統計。

2.3.2 生防功能有機肥對植煙土壤養分的影響 由表7可知，煙葉采收后各處理的土壤pH值均下降，以處理1的降幅最大;各處理有機質、全氮、全磷、全鉀和速效鉀含量差別不大;處理1、處理2、處理6的水解性氮含量增加，處理3、處理4、處理5降低;處理1、處理2、處理4、處理6的有效磷含量增加，處理3、處理5降低。

2.3.3 生防功能有機肥對烤煙農藝性狀的影響 移栽后55 d和采烤前各處理煙株農藝性狀調查結果見表8。移栽后55 d，處理4的農藝性狀優于其他處理，其株高與其他處理均差異顯著（P<0.05），莖圍與處理1、處理3差異顯著，單株葉數與處理1、處理2、處理3差異顯著，中部葉最大葉面積與處理1、處理2、處理3、處理6差異顯著。采烤前，以處理4的農藝性狀整體表現最優，其單株葉數與處理1、處理2、處理3差異顯著，中部葉最大葉面積與處理2、處理5、處理6差異顯著。

綜合來看，處理4在前期能夠促進煙株的早生快發，在后期能夠促進葉片開片，改善烤煙農藝性狀。

2.3.4 生防功能有機肥對烤煙病害發生情況的影響

2.3.4.1 生防功能有機肥對根結線蟲發生情況的影響 由表9可知，各處理的根結線蟲病情指數均在97.00以上，根系干質量差別也不大。說明在根結線蟲危害極為嚴重的地塊，生防功能有機肥對根結線蟲的防治效果不理想。

2.3.4.2 生防功能有機肥對烤煙其他主要病害的發生情況的影響 由表10可知，該地塊其他主要病害為青枯病，主要出現在烤煙生育前期，處理4、處理5、處理6的發病率低于處理1，說明生防功能有機肥9號、11號及12號對青枯病發生有抑制作用，其中處理4的病情指數最低，說明生防功能有機肥9號對青枯病預防效果最明顯。

2.3.5 生防功能生物有機肥料對煙株產值及產量的影響 由于前期干旱，后期整塊試驗地根結線蟲病危害極為嚴重，烤煙失去采烤價值，烤煙經濟性狀未統計。

2.3.6 生防功能有機肥對煙葉化學成分的影響 由于前期干旱，后期整塊試驗地根結線蟲病危害極為嚴重，烤煙失去采烤價值，烤煙未采烤，因此未分析煙葉化學成分。

3 結論與討論

本研究利用云南省微生物發酵工程研究中心有限公司菌種庫中7株具有殺線蟲功能的生防功能菌篩選出的發酵液研究發現，對煙草根結線蟲的校正致死率在80%以上的生防菌株包括 WSWFJ5、WSWFJ9、WSWFJ11、WSWFJ12共計4株，且均為芽孢桿菌，對根結線蟲的校正致死率分別達81.12%、84.28%、85.91%、82.36%，其發酵液隨著稀釋倍數的增加對線蟲滅殺活性逐漸下降，稀釋至320倍后滅殺活性完全喪失。同時，這4株生防功能菌發酵液對根結線蟲的校正致死率隨著處理時間的延長而升高，與譚可菲等的研究結果[21]一致，均在2 h以后效果最優，對煙草根結線蟲的校正致死率分別為79.94%、81.69%、81.59%、78.94%。將4株生防功能菌株直接用于發生煙草根結線蟲病煙株，其防效分別為44.32%、38.46%、46.84%、42.53%，與發酵液實驗室滅殺活性試驗結果未呈現出一致性，推測是因為在土壤中微生物環境較為復雜，各生防菌株生存能力及代謝物分泌的能力受到一定影響，但整體而言，4株生防功能菌對煙草根結線蟲均具有一定的抑殺作用，在溫室盆栽試驗中也表現出了一定防效。

將以上4株生防功能菌與另2株生防菌以及腐熟完全的萬壽菊秸稈有機肥按一定添加比例復配，在正常包裝堆放后，有機肥本身并不會出現再次升溫發酵的情況，同時，萬壽菊生防功能有機肥中功能菌有效活菌數達到生物有機肥標準且高于標準，證明該方案可行。

然后本研究采用田間小區試驗的方式，客觀評價以萬壽菊秸稈為原料開發的生防功能有機肥在曲靖煙區的應用效果。結果表明：不同處理間煙株的生育期表現一致，推測可能是由于試驗區域在煙株移栽后至團棵期間未有降雨，導致煙株前期的生育期增長;生防功能有機肥9號在前期能夠促進煙株的早生快發，在后期能夠促進葉片開片，改善烤煙農藝性狀，同時能夠提高烤煙對根結線蟲和青枯病的抗病性，減少病害的發生。

總而言之，在豐富的微生物資源中，可篩選出對煙草根結線蟲具有滅殺功能的菌株，并且可與腐熟的萬壽菊秸稈復配形成穩定且具有生防功能的有機肥。但在田間試驗中，由于氣候原因及試驗地選取不當而造成田間小區試驗效果不理想。針對此情況，本研究團隊將重新選取多個試驗地塊繼續進行生防功能有機肥的田間效果驗證，為生防功能有機肥在煙草根結線蟲防控方面提供理論基礎及技術支撐。

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