基于聚類分析的賀蘭山東麓不同釀酒葡萄品種根系抗寒性綜合評(píng)價(jià)

陳寧　徐國(guó)前　宋瑞　李強(qiáng)證　聞凱　張軍翔

摘要：以寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的17個(gè)釀酒葡萄品種一年生根系為試材，分別測(cè)定自由水/束縛水以及低溫脅迫后根系電導(dǎo)率與丙二醛含量等抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算各品種半致死溫度（LT50）。結(jié)果表明，隨著處理溫度的降低，葡萄根系電導(dǎo)率與丙二醛含量呈遞增趨勢(shì);根系抗寒性強(qiáng)的品種LT50低，自由水/束縛水值小，丙二醛增幅量小。對(duì)17個(gè)歐亞葡萄品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)合品種春季成活率，品種根系抗寒性可分為4類：一類為抗寒性強(qiáng)的品種威代爾;二類為抗寒性較強(qiáng)的品種小芒森;三類為抗寒性較弱的品種紫代夫、媚麗、雷司令、蛇龍珠、霞多麗、維歐尼、赤霞珠、品麗珠、泰娜特和西拉;四類為抗寒性弱的品種美樂(lè)、馬瑟蘭、小味兒多、貴人香和黑比諾。

關(guān)鍵詞：賀蘭山東麓;葡萄根系;抗寒性;聚類分析

中圖分類號(hào)：S663.103.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）04-0093-06

作者簡(jiǎn)介：陳寧（1995—），男，山東惠民人，碩士，研究方向?yàn)槠咸言耘嗯c釀酒。E-mail：chen0605qx@163.com。

通信作者：徐國(guó)前，博士，研究方向?yàn)槠咸言耘嗯c釀酒。E-mail：nxwine@yeah.net。

葡萄（VitisL.）是世界四大栽培果樹(shù)之一，我國(guó)葡萄產(chǎn)量和栽培種植面積居世界前列[1]，其中寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)是我國(guó)釀酒葡萄栽培種植面積最大的產(chǎn)區(qū)，適宜的自然條件可以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的葡萄酒。冬季嚴(yán)寒易發(fā)生凍害，葡萄根系是葡萄休眠期抗寒性最弱的器官，易遭受凍害的影響，因此根系抗寒性強(qiáng)弱成為葡萄越冬存活的關(guān)鍵因素。可以通過(guò)研究葡萄根系的抗寒性[2]，了解品種間抗寒差異，制定相應(yīng)的栽培技術(shù)措施提高越冬成活率。對(duì)根系抗寒性的鑒定方法有多種，從郭修武等和其他抗寒研究相關(guān)報(bào)道中選取了電導(dǎo)率[3-6]、半致死溫度（LT50）[7-8]、自由水與束縛水的含量及比值[9-10]和丙二醛含量[4]作為鑒定根系抗寒性的重要指標(biāo)，指標(biāo)變化規(guī)律如下：王飛等和王文舉等分別用電導(dǎo)率對(duì)杏和葡萄枝條測(cè)定抗寒性，發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率會(huì)隨溫度降低呈“S”曲線變化，植物抗寒性不同，電導(dǎo)率增加幅度不同[11-12];張倩等利用LT50測(cè)定不同葡萄種群抗寒能力，結(jié)果表明，美洲種抗寒性最強(qiáng)，歐亞種抗寒性最差[13];高振等以低溫放熱法研究葡萄根系抗寒性，結(jié)果表明，根系自由水含量越低，束縛水含量越高，自由水/束縛水比值越小，根系的LTS隸屬函數(shù)度越大，其抗寒性越好，栽培品種中芳提娜抗寒性最強(qiáng)，西拉、佳美娜、紫代夫和泰娜特抗寒性最差[14-15];李桂榮等對(duì)不同品種枝條研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)以及丙二醛含量隨著溫度降低呈升高趨勢(shì)，抗寒性不同其變化趨勢(shì)不一樣[16-17]。目前賀蘭山東麓絕大部分葡萄園用自根苗建園，抗寒力差，和嫁接苗相比受凍害威脅較大，防止凍害發(fā)生則增加越冬埋土量，埋出土用工大，生產(chǎn)成本高。本研究選取17個(gè)主栽釀酒葡萄品種，測(cè)定其根系相關(guān)生理生化指標(biāo)，對(duì)其抗寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，比較品種根系抗寒性強(qiáng)弱，為確定葡萄抗寒能力、實(shí)現(xiàn)按品種埋土管理栽培、降低生產(chǎn)成本提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試材選取自賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院葡萄種植基地，該地區(qū)屬溫寒帶干旱地區(qū)，灌溉條件為滴灌，土壤為沙壤土。共選擇17個(gè)歐亞葡萄品種（表1）作為試驗(yàn)材料，冬季埋土前取各品種地表下20～30cm土層內(nèi)粗細(xì)均勻的1年生根系，試驗(yàn)測(cè)定于2018年11—12月在寧夏大學(xué)葡萄與葡萄酒研究院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.2處理方法

將采集的根系去除須根，用自來(lái)水清洗2～3遍，再用去離子水清洗1～2遍，放入密封袋中，抽真空，置于4℃恒溫冰箱中待測(cè);在盡量保持根系不受破壞的情況下稱取每個(gè)品種根系12g，分3份，密封，抽真空，放入上海藍(lán)豹高低溫（交變）濕熱試驗(yàn)箱處理，處理溫度分別為-12、-9、-6、-3℃，及4℃（對(duì)照組）。以4℃/h速度進(jìn)行程序降溫，至目的溫度后持續(xù)12h，之后以同樣速度回升至4℃取出樣品，自封袋密封，測(cè)定抗寒指標(biāo)，重復(fù)3次。

1.3抗寒性指標(biāo)與測(cè)定方法

1.3.1相對(duì)電導(dǎo)率與半致死溫度

參照電導(dǎo)儀法[18]進(jìn)行測(cè)定，稱取0.5g根系放入離心管中，加10mL蒸餾水靜置12h，用雷磁DDS-307型電導(dǎo)儀測(cè)值記為R1，煮沸30min冷卻室溫測(cè)值記為R2，3次重復(fù)。計(jì)算：相對(duì)電導(dǎo)率=R1/R2×100%，結(jié)合相對(duì)電導(dǎo)率擬合Logistic方程y=k/（1+ae-bx），求方程二階導(dǎo)數(shù)并令其等于零，方程曲線拐點(diǎn)x=lna/b即為L(zhǎng)T50。

1.3.2生理指標(biāo)測(cè)定

自由水/束縛水比值和丙二醛含量測(cè)定參照王學(xué)奎《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)》中測(cè)定方法，自由水和束縛水含量在取樣后立即測(cè)定，丙二醛（MDA）含量經(jīng)過(guò)不同溫度處理后用硫代巴比妥酸法（TBA）測(cè)定，3次重復(fù)[18]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析方法

基本數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel進(jìn)行處理編輯，統(tǒng)計(jì)分析用SPSS25.0軟件進(jìn)行處理。

1.4.1方差分析

對(duì)3次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，比較每個(gè)溫度處理或每個(gè)指標(biāo)下17個(gè)品種之間的差異性，最終結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4.2聚類分析

選取-12℃溫度處理下的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA數(shù)據(jù)作為初始數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化=（初始值-對(duì)照值）/對(duì)照值。用標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、LT50、自由水/束縛水比值等4個(gè)指標(biāo)對(duì)17個(gè)葡萄根系進(jìn)行系統(tǒng)聚類，得到譜系圖，對(duì)葡萄根系抗寒性進(jìn)行分類。

2結(jié)果與分析

2.1低溫脅迫對(duì)葡萄根系電導(dǎo)率和LT50的影響

表2中是所有品種低溫處理后根系電導(dǎo)率的變化。隨著處理溫度的降低，所有品種根系電導(dǎo)率值均增大。對(duì)比4℃對(duì)照組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，除美樂(lè)和黑比諾外，其余品種電導(dǎo)率均低于50%，威代爾低于40%，其中馬瑟拉、品麗珠、霞多麗、維歐尼和雷司令之間差異性不顯著，泰娜特、西拉、蛇龍珠、小芒森和貴人香之間差異性不顯著;在-3℃下，所有品種電導(dǎo)率均高于對(duì)照，赤霞珠、紫代夫、西拉、品麗珠、媚麗、霞多麗、維歐尼和雷司令之間差異性不顯著;在-6℃下，所有品種電導(dǎo)率均高于-3℃處理，馬瑟蘭、小味兒多和霞多麗之間差異性不顯著;在-9℃下，所有品種電導(dǎo)率均高于-6℃處理，除小芒森、霞多麗和威代爾外，其余品種電導(dǎo)率均高于70%，美樂(lè)、馬瑟蘭、紫代夫、泰娜特和黑比諾之間差異性不顯著;在-12℃下，所有品種電導(dǎo)率均高于-9℃處理，除品麗珠、小芒森和威代爾外，其余品種電導(dǎo)率均高于80%，赤霞珠、黑比諾、媚麗、貴人香、霞多麗和維歐尼之間差異性不顯著。對(duì)比所有品種不同處理，威代爾與其他品種差異性均顯著。溫度下降時(shí)，對(duì)冷敏感度高的品種細(xì)胞質(zhì)膜透性會(huì)增加幅度較大，若溫度下降到植物所能抵抗的最低溫度以下時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜透性產(chǎn)生不可逆改變[19-20]，膜內(nèi)可溶性物質(zhì)外滲，使電導(dǎo)率逐漸升高。

根據(jù)所得品種電導(dǎo)率值（不包括對(duì)照組）進(jìn)行Logistic方程擬合，求得各品種LT50。由表3可知，擬合度R2均大于0.900，擬合度好，均達(dá)到顯著水平。比較發(fā)現(xiàn)根系抗寒性強(qiáng)的品種是威代爾和小芒森，其LT50分別為-6.92和-5.09;抗寒性弱的品種是小味兒多和黑比諾，其LT50分別為-2.70和-2.40。對(duì)品種LT50進(jìn)行品種根系抗寒性大小排序?yàn)橥鸂?小芒森>蛇龍珠>紫代夫>媚麗>雷司令>維歐尼>霞多麗>泰娜特>赤霞珠>品麗珠>西拉>貴人香>美樂(lè)>馬瑟蘭>小味兒多>黑比諾。

17個(gè)葡萄品種的相對(duì)電導(dǎo)率隨著處理溫度的下降而上升，且呈明顯的“S”形曲線。品種根系抗寒能力不同，低溫處理下電導(dǎo)率增加幅度不同;品種間擬合度不同，“S”形有所差異。圖1顯示的是抗寒性強(qiáng)的威代爾和抗寒性弱的黑比諾相對(duì)電導(dǎo)率變化規(guī)律。

2.217個(gè)品種葡萄根系自由水/束縛水含量的比較

由表4可知，自由水含量最高的是美樂(lè)，含量最低的是品麗珠，其中美樂(lè)和黑比諾差異性不顯著，紫代夫、西拉、蛇龍珠、品麗珠、媚麗、小芒森、維歐尼、雷司令和威代爾差異性不顯著;束縛水含量最高的是小芒森和威代爾，最低的是品麗珠，其中泰娜特、蛇龍珠、小芒森、維歐尼和威代爾差異性不顯著，其余差異性顯著;自由水/束縛水比值最大的美樂(lè)，最小的是威代爾，馬瑟蘭、小味兒多和黑比諾比值較大且差異性不顯著，蛇龍珠、小芒森、維歐尼和威代爾比值小且差異性不顯著。自由水/束縛水比值越大的其自由水含量越大、束縛水含量越小，抗寒性越差，比值越小的束縛水含量較高抗寒性較強(qiáng)。

2.3低溫脅迫對(duì)葡萄根系MDA含量的影響

由表5可知，隨著處理溫度的降低，所有品種MDA含量逐漸增加。17個(gè)供試品種在4℃下，葡萄根系產(chǎn)生了少量的MDA，威代爾含量最高，泰娜特、蛇龍珠和維歐尼含量較高且差異性不顯著，美樂(lè)、紫代夫和霞多麗含量較少且差異性不顯著;在-3℃下，MDA含量開(kāi)始增加，黑比諾和威代爾含量較高且差異性不顯著，馬瑟蘭含量最低與其他品種差異性顯著;在-6℃下，品麗珠和維歐尼含量較高且差異性不顯著，美樂(lè)和霞多麗含量較低且差異性不顯著;在-9℃下，除美樂(lè)外，其余品種含量均高于0.200μmol/g，泰娜特、品麗珠和黑比諾含量較高且差異性不顯著;在-12℃下，MDA含量達(dá)到最大值，小味兒多、泰娜特、西拉、品麗珠、黑比諾和小芒森含量較高且差異性不顯著，紫代夫含量最低。

隨處理溫度的降低，膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng)，MDA的含量不斷增加，對(duì)葡萄根系造成的傷害逐漸增強(qiáng)，但不同品種間含量增加幅度不同，說(shuō)明各品種間抗寒性差異顯著。增幅量與根系抗寒性有密切關(guān)系，丙二醛含量增加小的品種，受損傷程度較輕，抵抗低溫能力較強(qiáng)。威代爾、小芒森、蛇龍珠增幅量較小，分別為0.044、0.054、0.056μmol/g，抗寒性相對(duì)較強(qiáng);黑比諾、小味兒多、馬瑟蘭增幅量較大，分別為0.083、0.091、0.097μmol/g，抗寒性相對(duì)較差。

2.4品種春季出土成活率比較

西北地區(qū)葡萄越冬需埋土防寒，越冬期間埋土厚度為30～40cm，埋土寬度為60～80cm。如表6所示，威代爾成活率最高，達(dá)90%;其次泰娜特、黑比諾、小芒森、雷司令和小味兒多成活率也達(dá)到80%以上;成活率較低的是西拉和馬瑟蘭，在70%以下。品種成活率普遍不高，推測(cè)可能埋土厚度不夠，以及越冬期間管理不夠，使得春季出土后成活率較低。

2.5聚類分析對(duì)葡萄根系抗寒性的綜合評(píng)價(jià)

用標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、LT50、自由水/束縛水比值等4個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)對(duì)17個(gè)葡萄根系抗寒性進(jìn)行系統(tǒng)聚類，得到譜系圖。如圖2所示，可以將葡萄根系抗寒性分為以下4類：紫代夫、媚麗、雷司令、蛇龍珠、霞多麗、維歐尼、赤霞珠、品麗珠、泰娜特和西拉特性相近為一類;美樂(lè)、馬瑟蘭、小味兒多、貴人香和黑比諾特性相近為一類;小芒森為一類;威代爾為一類。

3討論與結(jié)論

低溫脅迫會(huì)使細(xì)胞滲透液含量增加，隨著低溫的不斷增大，電解質(zhì)滲出率增加。本試驗(yàn)中，隨處理溫度的下降，根系電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，整體變化趨勢(shì)呈“S”形，與張倩等的研究結(jié)果[13-21]一致。其中LT50反映了溫度與抗寒性的數(shù)量關(guān)系[22]，LT50越低，抗寒性越好;反之，LT50越高，抗寒性越差[23-24]。本研究中威代爾、小芒森、蛇龍珠和維歐尼自由水與束縛水比值小;美樂(lè)自由水/束縛水比值大。研究證明自由水/束縛水比值與抗寒性呈負(fù)相關(guān)[8-9]，自由水/束縛水比值越小，抗寒性越強(qiáng)。在低溫下細(xì)胞質(zhì)膜透性減弱，丙二醛含量升高[25]，其含量可以反映植物遭受逆境傷害程度大小。本研究中葡萄根系在低溫處理后MDA含量及變化規(guī)律表明，隨處理溫度降低，各品種根系中MDA含量增大且增加幅度不同。MDA含量低且增加幅度小，抗寒性強(qiáng);含量高且增加幅度大，抗寒性弱[26]。如威代爾、小芒森、蛇龍珠增幅量較小，抗寒性相對(duì)較強(qiáng)，而黑比諾、小味兒多、馬瑟蘭增幅量較大，抗寒性相對(duì)較弱。

對(duì)17個(gè)歐亞葡萄品種進(jìn)行聚類分析，將品種根系抗寒性分為4類：一類抗寒性強(qiáng)的品種威代爾;二類抗寒性較強(qiáng)的品種小芒森;三類抗寒性較弱的品種紫代夫、媚麗、雷司令、蛇龍珠、霞多麗、維歐尼、赤霞珠、品麗珠、泰娜特和西拉;四類抗寒性弱的品種美樂(lè)、馬瑟蘭、小味兒多、貴人香和黑比諾。將結(jié)果與春季成活率對(duì)比，威代爾抗寒性最強(qiáng)，成活率最高;小芒森抗寒性較強(qiáng)，成活率較高;紫代夫、媚麗、蛇龍珠、霞多麗、維歐尼、赤霞珠和品麗珠等品種成活率在70%～80%，品種抗寒性可歸為一類;馬瑟蘭抗寒性最弱，成活率也最低;其余品種成活率和抗寒性大致符合，與其他同類品種有差異可能是因?yàn)樵蕉陂g防護(hù)有限導(dǎo)致越冬受損。葡萄根系抗寒性是受多因素綜合影響，除生理指標(biāo)外，還須從其他方面進(jìn)行研究。此次研究通過(guò)將品種根系抗寒性進(jìn)行分類，可使得越冬管理上對(duì)抗寒性相近的不同品種進(jìn)行統(tǒng)一管理，通過(guò)抗寒性強(qiáng)弱來(lái)制定不同的管理措施，減少生產(chǎn)成本。選育種質(zhì)資源還應(yīng)結(jié)合其他因素來(lái)研究分析抗寒機(jī)制，為抗寒育種提供理論支持。

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