抗菌肽Omiganan的克隆、表達和抑菌活性

謝 昆，李密杰，蔣成硯，魯海菊，孔 瓊，何 超，沈登榮

(1.紅河學院 生命科學與技術學院，云南 蒙自 661199；2.云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南 蒙自 661199)

抗菌肽又稱抗微生物肽或者宿主防御肽，是自然界長期進化形成的，廣泛存在于動植物及微生物等生物體內，對抗外源性病原體致病作用的一類生物活性多肽物質，是生物疾病防御與免疫系統的一個重要組成部分，是一種重要而優秀的天然抗病因子[1-3]。Omiganan是Sader等[4]于2004年人工合成的一種抗菌肽，由12個氨基酸組成，一級結構為NH2-ILRWPWWPWRRK-COOH，具有廣譜的抑菌活性，能抑制金黃色葡萄球菌(S. aureus)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Meticillin-resistant S. aureus，MRSA)，甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(Meticillin-sensitive Staphylococcus Epidermidis，MSSE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(Meticillinresistant S. epidermidis，MRSE)、大腸桿菌(E.coli)，陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、耐萬古霉素糞腸球菌(Vancomycinresistant Enterococcus faecium，VRE)、萬古霉素敏感糞腸球菌(Vancomycinsensitive Enterococcus faecalis，VSE)、沙雷氏菌(Serratia marcescens)等細菌的生長，也能抑制白色念珠菌(Candida albicans)等真菌[5-6]，還能與干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)等協調作用治療人類乳頭瘤病毒(HPV)引起的皮膚疾病等，具有廣泛的用途[7-8]。本研究根據Omiganan的氨基酸序列和大腸桿菌密碼子、畢赤酵母密碼子偏愛性特點，推斷出Omiganan基因的核苷酸序列，然后根據該序列設計特異性引物，應用引物互補和PCR技術擴增出Omiganan基因，構建pET32a-Omiganan原核表達載體和pPIC9K-Omiganan畢赤酵母真核表達載體，將pET32a-Omiganan原核表達載體轉化BL21感受態細胞，篩選奠定出陽性重組菌，通過IPTG和自誘導表達系統表達Omiganan重組蛋白，將pPIC9K-Omiganan畢赤酵母真核表達載體轉化GS115感受態細胞，篩選奠定出陽性重組菌，應用GMMY培養基，通過1%甲醇誘導發酵液72 h表達Omiganan抗菌肽，將獲得的抗菌肽進行大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌試驗，為基因工程技術獲得具有抑菌活性的抗菌肽Omiganan奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗試劑

質粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，均購自愛思進生物技術(杭州)有限公司；PrimeSTAR高保真酶、TALON?Metal Affinity Resins鈷離子蛋白純化試劑盒(貨號：635501)購自寶生物工程(大連)有限公司；T4DNA鏈接酶、限制性核酸內切酶，均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DL2000 DNA Marker、低分子量蛋白Marker，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司

1.2 Omiganan基因的克隆

根據報道的Omiganan氨基酸序列(NH2-ILRWPWWPWRRK-COOH)，參考大腸桿菌和畢赤酵母偏愛密碼子特征，分別推導出Omiganan基因的核苷酸序列，大小36 bp。應用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計2對互補引物，以引物互為模板，PCR擴增Omiganan基因，設計的引物序列和推斷的基因序列如表1，2。

表1 根據大腸桿菌偏愛密碼子推斷的Omiganan基因和特異性引物Tab.1 The deduced Omiganan gene according to E. coli codons preference and designed specific primers

表2 根據畢赤酵母偏愛密碼子推斷的Omiganan基因和特異性引物Tab.2 The deduced Omiganan gene according to Pichia pastoris codons preference and designed specific primers

將2條引物混合混勻，分別加入高保真Pfu聚合酶、dNTP、10×Pfu聚合酶Buffer，PCR反應條件為：98 ℃ 10 s →(94 ℃ 10 s → 55 ℃ 5 s → 72 ℃ 5 s)×35 個循環→72 ℃ 10 min →4 ℃ 保存，利用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，采用膠回收試劑盒純化PCR產物。

1.3 pET32a-Omiganan表達載體的構建

分別應用KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切PCR產物和pET32a質粒，得到Omiganan基因片段和pET32a載體大片段，利用T4DNA連接酶分別連接雙酶切后的Omiganan和pET32a，構建pET32a-Omiganan表達載體，轉化BL21感受態細胞，在含100 μg/mL氨芐青霉素的固體LB平板上挑取單菌落，置含氨芐青霉素的液體LB培養液中37 ℃搖床培養過夜，將菌液PCR鑒定為陽性的菌液于4 ℃保存。

1.4 pPIC9K-Omiganan畢赤酵母表達載體的構建

分別應用EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切PCR產物和pPIC9K質粒，得到Omiganan基因片段和pPIC9K載體大片段，利用T4DNA連接酶分別連接雙酶切后的Omiganan和pPIC9K，構建pPIC9K-Omiganan畢赤酵母表達載體，經過SalⅠ酶線性化，電轉化GS115感受態細胞，取100 μL混合物涂布于SPMD平板，28 ℃培養2～5 d，將轉化的酵母經過SPMD平板篩選出His+表型菌落，從中挑取96個單菌落用96孔細胞培養板進行3次YPD液體的同步培養，然后在含有2.0 g/L G418的YPD平板上進行多拷貝篩選，最后選取長勢最好的菌落進行轉化子驗證。

1.5 Omiganan抗菌肽的二級結構預測及抗原性分析

應用DNAStar對Omiganan抗菌肽的一級結構進行抗原性分析。

1.6 Omiganan重組抗菌肽的表達

將陽性菌液在37 ℃ 200 r/min搖床培養至OD600=0.6時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，分別于25，37 ℃ 2種溫度誘導表達重組蛋白，分別收集誘導0～6 h的菌液1 mL，將收集的菌液10 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用5 ×蛋白上樣緩沖液和1×PBS懸浮，總體積100 μL，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況，分析不同表達時段重組蛋白表達產率差異。

1.7 Omiganan重組蛋白的自誘導表達

按照Studie的方法進行自誘導表達研究[9]。挑取含有重組質粒的單菌落，接種到 4 mL 含有100 μg/mL Amp 的LB 培養基中，37 ℃、220 r/min 培養過夜，再按 1%的接種量接種到10 mL 含有 100 μg/mL Amp 的 ZYM5052 培養基中， 37 ℃、220 r/min 培養過夜約14 h，收集菌液，與 IPTG 誘導的菌液進行SDS-PAGE電泳分析，比較兩者重組蛋白表達產率的差異。

1.8 Omiganan重組蛋白的純化

收集自誘導表達菌液，應用TALON?Metal Affinity Resins鈷離子蛋白純化試劑盒(貨號：635501)對Omiganan重組蛋白進行純化，具體純化方法參考說明書。

1.9 抗菌肽Omiganan在畢赤酵母中的表達

取驗證過的酵母菌株接種于BMGY培養基中，于28 ℃，200 r/min的搖床振蕩培養至OD600達到2.0～6.0時，離心收集細胞，重懸于BMMY培養基中，使OD600為1.0，28 ℃繼續振蕩培養，每隔24 h加1次甲醇至終濃度為1%誘導抗菌肽Omiganan的表達，收集誘導72 h的表達液上清，15% SDS-PAGE檢測抗菌肽Omiganan的表達，上清液于-20 ℃保存。

1.10 抗菌肽Omiganan的抑菌活性研究

分別以大腸桿菌(ATCC8739)和金黃色葡萄球菌(ATCC25923)為受試菌株，抑菌圈法檢測抗菌肽Omiganan表達液上清對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用。

2 結果與分析

2.1 Omiganan基因的克隆

以引物互為模板，經過PCR擴增，獲得大小約69 bp的片段(圖1)，與預期結果一致。

2.2 Omiganan抗菌肽的二級結構預測及抗原性分析

用DNAStar對克隆Omiganan抗菌肽的氨基酸序列進行蛋白質二級結構預測與抗原性分析后，可以看到Omiganan抗菌肽具有1個α-螺旋，1個β-折疊，3個β-轉角和2個無規則卷曲。抗原性強的氨基酸位點在9-12位，非抗原性的氨基酸位點在1-8位，親水性強，說明Omiganan抗菌肽疏水性弱(圖2)。

2.3 Omiganan抗菌肽重組蛋白的表達

含pET32a-Omiganan重組質粒的菌液經IPTG 25，37 ℃ 2種溫度誘導和乳糖培養基自誘導10，12，14，16，18 h后，SDS-PAGE檢測Omiganan抗菌肽重組蛋白的表達(圖3-5)，從圖中可以看出，表達的重組蛋白大小約為18.7 ku，IPTG 25，37 ℃ 2種溫度誘導的重組蛋白表達率無顯著差異，以自誘導14 h重組蛋白含量最高。

2.4 Omiganan重組蛋白的純化

收集自誘導表達14 h的菌液，經裂解后發現Omiganan重組蛋白位于上清，應用TALON? Metal Affinity Resins鈷離子蛋白純化試劑盒(貨號：635501)對上清液中Omiganan重組蛋白進行純化，結果如圖6，從圖中可以看出，純化的Omiganan重組蛋白條帶單一，濃度較高。

2.5 抗菌肽Omiganan在畢赤酵母中的表達

在含1%甲醇濃度的BMMY培養基中誘導表達抗菌肽Omiganan 72 h，菌液經12 000 r/min離心20 min，取上清液制樣，1.5% SDS-PAGE檢測抗菌肽Omiganan在畢赤酵母中的表達情況，結果如圖7，從圖中可以看出，抗菌肽Omiganan大小約為1.8 ku，與預期結果一致。

2.6 抗菌肽Omiganan的抑菌活性研究

應用抑菌圈法，檢測Omiganan表達液上清分別對大腸桿菌(ATCC8739)和金黃色葡萄球菌(ATCC25923)的抑菌效果(圖8)，上清液體積分別為10，20，30，40，50 μL，以50 μL濃度為100 μg/mL的AMP為陽性對照，50 μL滅菌水為陰性對照，結果表明，AMP對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，而對大腸桿菌沒有抑菌效果，Omiganan表達液上清對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，40 μL

的發酵上清液即對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用，而金黃色葡萄球菌的抑菌作用弱于AMP。

3 討論

抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤和免疫調節等多種功能，而且抗菌肽主要是通過物理電性作用的方式破壞細菌的細胞膜，是一種物理的方式，造成結構性的損壞，細菌對這種物理破壞細胞結構的作用機制無法對抗而產生適應性和耐受性，在理論和作用機制上，抗菌肽不論在什么情況下都不會引起細菌的耐藥性產生，因此，抗菌肽作為具有取代抗生素使用潛力的藥物項目，已成為研究的熱點[10-12]。目前的研究結果表明，抗菌肽豐富的種類、廣泛的作用和優良的性能，尤其是高效的抗微生物活性，作為抗生素的替代品，具備極大的可能性。不僅如此，抗菌肽被賦予的更大期望是，在對付如腫瘤、艾滋病等人類疑難病癥，可以發揮有效的作用[13-15]。

文獻報道Omiganan抗菌肽展現出強大的抑菌活性，不僅對細菌還是真菌都有抑菌效果。Rijsbergen等[7-8]發現在臨床上局部應用Omiganan抗菌肽對肛門生殖器疣(AGW)和尺上鱗狀上皮內病變(HSIL)等疾病具有明顯改善作用，同時對HPV也具有良好的治療作用，顯示了Omiganan具有廣泛的應用前景，特別是作為外用藥在皮膚疾病的治療中效果明顯。近年來，抗菌肽在飼料添加劑、耐抗生素類耐藥菌、化妝品和牙周炎等方面都有研究和應用[16-21]，顯示了其廣泛的應用范圍，對Omiganan的抑菌活性研究有助于發掘其在皮膚疾病治療中的重要作用。

本研究根據抗菌肽Omiganan的一級結構和大腸桿菌、畢赤酵母偏愛密碼子原則，分別推斷Omiganan的基因序列，根據基因序列設計2對特異性引物，通過PCR技術擴增出Omiganan基因，并與pET32a原核表達載體和pPIC9K畢赤酵母表達載體連接構建pET32a-Omiganan和pPIC9K-Omiganan表達載體，對原核表達載體，采用自誘導和IPTG誘導Omiganan抗菌肽重組蛋白，結果發現自誘導和IPTG都能誘導Omiganan的表達，而以自誘導14 h后的表達率最高，誘導的Omiganan重組蛋白大小18.7 ku，包含pET32a上的一段表達序列和腸激酶識別位點，后期將應用腸激酶切割Omiganan重組蛋白，獲得只含有12個氨基酸組成的Omiganan抗菌肽。對構建的pPIC9K-Omiganan畢赤酵母表達載體，點轉化GS115感受態細胞后，應用1%甲醇誘導Omiganan抗菌肽的表達，發現表達的Omiganan對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，該研究為后續的抑菌活性研究及抗菌肽的應用奠定了基礎。