硝化抑制劑和肥料減施對減少設施菜田氮源氣體排放及與微生物功能基因的互作

王 凌，張國印，劉孟朝，孫世友，劉 蕾，茹淑華，趙歐亞，李博文

(1.河北農業大學 資源與環境科學學院，河北 保定 071001；2.河北省農林科學院 農業資源環境研究所，河北 石家莊 050051；3.河北省肥料技術創新中心，河北 石家莊 050051)

菜田氮養分調控是減施肥料增效的核心關鍵，其中微生物在氮元素的循環中發揮了重要作用[16-17]。近幾年，利用硝化抑制劑調控氮素循環的研究方興未艾。由于其效果好、成本低、對環境的危害小等優點在農業中廣泛應用，常用的硝化抑制劑有雙氰胺(DCD)、2-氯-6三氯甲基吡啶(Nitrapyrin)、3-4甲基吡唑磷酸鹽(DMPP)等。它們在新西蘭高氮草地、中國南方酸性水稻土及亞熱帶蔬菜土壤中提高土壤氮肥效率、減少硝酸鹽淋失、降低溫室氣體排放以及提高作物產量等方面已有些報道[18-27]。然而，在我國華北集約化菜田的石灰性土壤中，運用硝化抑制劑減少氮源氣體，特別是氮氧化物(NOx)的排放報道較少，尤其是與氨氧化古菌AOA的作用關系更是鮮見報道。本試驗深入研究并明晰了硝化抑制劑施用和肥料減施對減少設施菜田NOx、N2O等氮源氣體排放及與氨氧化古菌AOA的作用關系，并應用高通量Illumina MiSeq平臺測序，利用PICRUSt對16S rDNAV3-V4區基因系列數據進行分析，基于KEGG數據庫對與氮代謝相關的功能基因進行了鑒定。為提高華北設施菜田養分利用率，有效防控農業面源污染，切實保障蔬菜食品安全和生態環境安全，促進我國農業高質量綠色發展提供有力的科學依據。

1 材料和方法

1.1 供試土壤

本試驗設置于國家農業部鹿泉農業環境科學觀測實驗站-石家莊市鹿泉市大河鎮河北省農林科學院試驗站內溫室中，開始于2015年，連續種植至今。該地屬于河北山前平原區、溫帶大陸性季風氣候，土壤類型為石灰性褐土，其表層土壤(0～20 cm)基礎理化性質如下：硝態氮60.2 mg/kg，銨態氮1.01 mg/kg，有效磷28.37 mg/kg，速效鉀73.50 mg/kg，全氮1.14 g/kg，全磷0.82 g/kg，全鉀19.19 g/kg，有機質14.32 g/kg，pH值8.2，容重1.45 g/cm3。

1.2 試驗材料

供試植物為黃瓜，品種為津優1號。DCD為雙氰胺分析純化學試劑，國藥集團化學試劑有限公司出品；吡啶為2-氯-6-三氯甲基吡啶，活性成分含量為200 g/L，美國陶氏益農公司出品；供試氮磷鉀肥料分別為尿素 (N 含量 46%)、重過磷酸鈣 (P2O5含量46%)、氯化鉀 (K2O含量60%)。

1.3 試驗設置

試驗共設計5個處理：不施肥的空白對照(處理CK)，農民常規施肥(處理FT)，常規施肥增施硝化抑制劑DCD(處理In-1)，常規施肥增施硝化抑制劑吡啶(處理In-2)，常規施用量的基礎上減量25%施肥(處理OPT)，每個處理設置3次重復，各處理的施肥方案如表2所示，DCD和吡啶用量均為施氮量的15%[27]。作物統一管理，肥料總施用量如表1，有機肥隨底肥一次性施入，化肥在底肥時期施入總投入量的60%，后期分別在花期追肥1次(為總投入量的10%)，果期追肥2次(先后分別為總投入量的20%和10%)。硝化抑制劑隨化肥一同通過追肥罐隨水施入。灌水采用滴灌方式，用土壤時域反射儀TDR(Time Domain Reflectometry)進行土壤水分的監測，保持田間持水量70%，每一生長季共灌溉5次，全生育期總灌溉量約為3 375 m3/hm2。作物生長周期均為120 d。

表1 不同施肥處理氮調控試驗的肥料施用量Tab.1 The different treatments with different fertilizer input in nitrification process regulation experiment

1.4 氮源氣體及土壤樣品采集及測定方法

在黃瓜完整生長周期內每次追肥和灌溉后，連續采集7～10 d的氮氧化物(NOx)、氧化亞氮(N2O)等氮源氣體樣品。氮源氣體各年度數據規律趨同，本研究采用數據為2018年采集；氮肥偏生產力的數據為2015-2020年采集。

在黃瓜完整生長周期內的初花期、盛瓜期、末瓜期等各個時期，尤其是每次追肥和灌溉后，連續記錄7～10 d的溫度、濕度條件參數，開展了氧化亞氮(N2O)、氮氧化物(NOx)等氮源氣體的定位監測，掌握不同處理的排放規律。

氧化亞氮(N2O)氣體的采集與測定：采用密閉式靜態箱法[28]，箱體由兩部分組成：上部箱體為體積為長 0.5 m、寬0.5 cm、高0.5 m的不銹鋼框架+亞克力面板，外面包裹保溫棉制成，箱體頂部設一氣體取樣口，底部開口可罩在底座上；下部底座為結合部位為不銹鋼框的正方形(橫截面)U型(縱剖面)水槽內，底座插入 25 cm 土層中固定。抽氣取樣時，水封槽內注滿水，然后將氣密室密封罩扣入有水槽的底座上，形成一個密閉性氣體空間，密閉后采用箱內的風扇將氣體攪勻。底肥和每次追肥后(水肥一體化追肥，硝化抑制劑一同施入)，連續采樣 7～10 d，采樣時間為每天10:00-12:00，每次分別在 0，10，20 min收集密閉箱之氣樣，并記錄采集氣樣的同步時間內采樣箱內溫度。利用針管采集35 mL氣體到20 mL密封且提前抽真空的玻璃氣瓶中，帶回實驗室后，用氣相色譜(Agilent7890B，美國)進行氣體樣品N2O含量的測定。

氮氧化物(NOx)的采集與測定：方法與上述N2O的采集方法相同，將采集到的氣體樣品先轉移到預先抽真空的容積為 200 mL 的氣袋中，帶回實驗室后，采用化學發光法[29](Thermo 42i氮氧化物分析儀，美國)進行測定。

其中：F為N2O或NOx排放通量(g/(hm2·d))，ρ為標準狀態下被測氣體的密度(g/L),H為箱子高度(cm)，P為采樣點大氣壓強(100 kPa)，P標為標準狀態下大氣壓強(100 kPa)，ΔC/Δt為單位時間內被測氣體質量分數變化速率(μg/(g·min))。

其中：N2O/NOx排放總量Q單位為kg/hm2；F為N2O/NOx排放通量為g/(hm2·d)，i為按時間排序的采樣，n為作物生育期總采樣次數。

土壤樣品采集與微生物功能基因測定：黃瓜收獲以后，分別采集用于測定土壤常規理化指標的表層(0～20 cm)土壤樣品2 kg，以及進行微生物多樣性和功能基因分析的根際土壤樣品適量。表層土壤樣品采集，用“S”法均勻采取蔬菜采樣點的根系土深度約為0～20 cm，土樣充分混合后，四分法留取重量約為1 kg，鮮樣0～4 ℃冷藏備測；風干樣品，過2 mm篩備測。用于土壤理化指標包括銨態氮、硝態氮，有機質，pH值等的分析測定[30]。關于進行土壤微生物功能基因的樣品采集，對于每棵黃瓜根系，都有大約20 cm深的土壤核心，將根際浮土進行人工抖動去除，用去離子水沖洗根際土每株根約100 mL并微波震蕩，每棵植株的距離為15～20 cm。將每個小區連續采集3棵黃瓜植株根際土壤進行混合，這些根際土被用于DNA提取[31]。本研究采用的微生物功能基因數據為2020年采集的土壤樣品測得。

對參與氮代謝的功能基因進行了PCR擴增，并在高通量Illumina MiSeq系統平臺測序，氨氧化古菌AOAamoA基因引物信息如下：Arch-amoA26F:5′-GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC-3′；Arch-amo

A417R:5′-GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG-3′[32]。

氮肥偏生產力的計算：根據作物經濟產量和氮肥施用量計算氮肥偏生產力(Partial Factor Productivity of Nitrogen，PFPN)，公式為：PFPN(kg/kg)= 作物經濟產量/肥料氮投入量[33]。

2 結果與分析

2.1 硝化抑制劑施用和肥料減施對設施黃瓜菜田氮氧化物排放的影響

由圖1顯示，在基肥施入播種后的7 d以及追肥后的7 d，均為農田氮氧化物NOx排放較高的時期，增施硝化抑制劑可顯著抑制華北設施菜田氮氧化物NOx的排放。各施肥處理中以常規施肥(處理FT)下的NOx排放通量最大，峰值為139.3 g/(hm2·d)；與常規施肥(處理FT)相比，增施DCD(處理In-1)和吡啶(處理In-2)均使氮氧化物(NOx)排放量有明顯降低，除不施肥的對照(處理CK)外，以增施DCD(處理In-1)的NOx排放通量最低。由圖2可知，增施DCD(處理In-1)的NOx排放總量顯著低于其他施肥處理，分別比農民常規施肥處理(FT)和減量施肥處理(OPT)的NOx排放總量減少了76.5%，71.8%。

2.2 硝化抑制劑施用和肥料減施對設施黃瓜農田土壤N2O排放的影響

如圖3所示，增施硝化抑制劑和減量施肥均能有效降低氧化亞氮(N2O)的排放，且基肥施用后N2O排放通量顯著高于追肥。各施肥處理間，常規施肥(處理FT)的N2O排放通量最高，最大排放通量達108.3 g/(hm2·d)，以增施硝化抑制劑吡啶(處理In-2)下N2O排放通量最低，較常規施肥(處理FT)下降31.2%。由圖4可見，設施黃瓜菜田全生育期各處理的氧化亞氮(N2O)排放總量差異顯著，常規施肥(處理FT)排放總量最大，以減量施肥(處理OPT)最低；減量施肥(OPT)、施用硝化抑制劑DCD(處理In-1)和吡啶(處理In-2)三者的N2O排放總量顯著低于常規施肥(處理FT)，降幅分別為28.4%，21.8%，20.6%，三者間差異不顯著。

2.3 硝化抑制劑施用和肥料減施對氨氧化古菌AOA的影響及其與NOx排放量之間的作用關系

2.3.1 不同施肥處理對氨氧化古菌AOA的amoA基因拷貝數的影響 如圖5結果顯示，在第5年當季施入各處理投入品40 d時，土壤中氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數存在顯著差異(P<0.05)。與常規施肥(處理FT)相比，在增施硝化抑制劑DCD(處理In-1)的調控下，土壤中氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數受到了抑制，僅為農民常規施肥(處理FT)的20%；增施吡啶(處理In-2)未對氨氧化古菌AOA的數量產生顯著影響；而減量25%施肥(處理OPT)的氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數，與農民常規施肥(處理FT)相比均有明顯下降，降幅分別達29.8%，但仍顯著高于增施硝化抑制劑DCD(In-1)的處理。結果表明，施用肥料特別是有機肥，會使耕層土壤中氨氧化古菌AOA數量顯著提升，但在相同施肥量的條件下，增施硝化抑制劑DCD(處理In-1) ，與常規施肥(處理FT)相比，會顯著抑制土壤中氨氧化古菌AOA數量，從而達到了抑制氨氧化作用的目的，減少氮素在農田中的損失。

2.3.2 氨氧化古菌AOA與設施菜田NOx排放量的關系 通過分析氨氧化功能基因與NOx排放量的相關性發現，氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數和設施菜田NOx排放總量之間存在顯著的指數型方程關系(圖6)，其方程如下：

Y= 121.18e3E-08x,R2=0.840 5,P<0.05

Y是設施菜田單位面積內NOx排放總量，x是在當季施入各處理投入品40 d時所采集的土壤樣品進行的qPCR擴增分析而得的氨氧化古菌AOA的數量。隨著氨氧化古菌AOA種群數量的增加，設施菜田NOx排放總量方程銳升的趨勢。

2.4 硝化抑制劑和減量施肥調控下微生物功能基因響應

圖7所示，在硝化抑制劑和肥料減量施用的調控下，對豐度前50位已知的最小單元功能群類的直系同源基因簇進行聚類分析，以進行物種身份與功能通路對應關系比對，對該環境下物種組成功能基因挖掘具有重要意義。PICRUSt預測法分析的結果表明，紅色條塊代表在對應樣本中豐度較高的功能類群，對照KEGG數據庫的代謝功能，除不施肥的對照(處理CK)外，減量25%施肥(處理OPT)以及硝化抑制劑(處理In-2)下，烯酰水合酶(Enoyl-CoA hydratase，K01692)、底物結合蛋白(Substrate-binding protein，K02035)和轉運系統ATP結合蛋白(Trans-port system ATP-binding protein，K09687)系統代謝通路相關的功能基因相對豐度高，是響應上述調控變化最為敏感的氮循環途徑。該發現將為數百個未開發的氮循環功能微生物群落提供有用的見解，為下一步深入研究提高功能微生物的作用效率奠定了堅實基礎。

2.5 硝化抑制劑調控在設施黃瓜菜田系統下的肥料利用率方面差異分析

由表2可知，減量施肥(處理OPT)的肥料偏生產力是各施肥處理中最高的。5 a間，與常規施肥(處理FT)相比，減量施肥(處理OPT)的肥料偏生產力提升了32.1%～38.2%，且與其他處理差異顯著，但后2 a有下降的趨勢，有待后續試驗觀察；增施硝化抑制劑DCD(處理In-1)的偏生產力也較高，與常規施肥(處理FT)相比提升了17.8%～21.9%，且差異顯著。結果表明，在該試驗土壤肥力水平下，減量施肥和增施硝化抑制劑均可顯著提高肥料利用率，其效果排序為減量施肥>增施DCD>增施吡啶。

表2 硝化抑制劑調控下設施黃瓜菜田肥料偏生產力差異分析Tab.2 Analysis on the difference of partial factor productivity of fertilizer with nitrification inhibitor regulation in greenhouse cucumber field kg/kg

3 結論與討論

3.1 討論

對比此前文獻報道，Di等[10,19]發現在新西蘭高氮草地酸性土壤施用DCD可使放牧草場系統 N2O 氣體排放量降低了 75%～80%。Menéndez等[24]在西班牙北部的一種混合的三葉草-黑麥草草場應用DMPP，使N2O和NO的排放量分別減少了29%和25%。Cui 等[25]的研究結果表明，在集約化的蔬菜生產系統的黃棕壤和潮土中，施用 DCD 使得N2O排放因子分別降低了83.8%和72.7%。本試驗是在石灰性褐土中的結果，與上述報道的施用DCD可使N2O 氣體排放降低趨勢一致，而降低的排放量有所差異，推測與試驗土壤的理化性質及作物不同相關。并且，本研究涉及的硝化抑制劑對華北石灰性菜田土壤氮氧化物排放(NOx)的作用效果鮮有報道，為本試驗的創新性研究結果。

此前報道顯示，Di等[18]在新西蘭高氮草地酸性土壤發現DCD可顯著抑制氨氧化細菌AOB的數量，但對 AOA 無明顯影響，He等[20]在我國南方酸性紅壤水稻土發現DCD有顯著抑制氨氧化古菌AOA的效果。本試驗結果顯示，在北方石灰性褐土設施黃瓜菜田中，增施DCD可顯著抑制氨氧化古菌AOA種群數量，該結果既與高氮草地酸性土壤結果不同，又與我國南方酸性紅壤的土壤性質不同，是對DCD在不同土壤類型pH值及有機質含量等理化性質不同的環境中作用效果的又一有力補充。推測其原因可能在于不同土壤中優勢氨氧化菌群對不同硝化抑制劑的敏感性不同有關[21]。并且本試驗創新性地揭示了氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數與土壤NOx排放通量之間的函數關系。

該試驗創新性發現我國北方石灰性菜田土壤中，響應增施硝化抑制劑和肥料減量調控變化最為敏感的功能微生物氮循環代謝途徑，與此前報道對比，雖在微咸水、冰川流及厭氧處理等不同生態系統環境[34-36]中參與氮循環的細菌代謝通路有所差異，但均證實了許多鮮為人知的、具有良好特性的功能細菌的存在。

該試驗結果與此前報道的，在栽培基質中、棕壤中減量施肥以及黃棕壤中施用DCD的報道結果接近[25,37-38]。田間條件下上述試驗結果的持續再現性如何，還有待進一步驗證。

3.2 結論

第一，北方設施黃瓜-土壤菜田系統中，增施硝化抑制劑和減量施肥均能有效降低氮氧化物(NOx)和氧化亞氮(N2O)的排放，特別是在底肥施用期效果最為顯著。增施硝化抑制劑DCD(處理In-1)與常規施肥(處理FT)和減量施肥(處理OPT)相比，每年向環境排放的氮氧化物(NOx)排放總量分別減少76.5%和71.8%，減量施肥(處理OPT)和增施DCD分別比常規施肥(處理FT)氧化亞氮(N2O)年排放總量減少28.4%和21.8%。第二，本結果進一步顯示，在北方石灰性褐土設施黃瓜菜田中，增施DCD可顯著抑制氨氧化古菌AOA種群數量，且綜合效果明顯優于吡啶；此外，氨氧化古菌AOA對NOx排放起調控作用，氨氧化古菌AOAamoA基因拷貝數與土壤NOx排放通量之間呈指數正相關關系：Y=121.18e3E-08x(R2=0.840 5,P<0.05)，并且隨著氨氧化古菌AOA種群數量的增加，NOx的排放通量呈指數銳升。第三，本試驗應用高通量Illumina MiSeq平臺測序，利用國際通用的PICRUSt工具對16S rDNAV3-V4區基因系列數據進行分析，基于KEGG數據庫的鑒定結果顯示，在肥料減施(處理OPT)和硝化抑制劑(處理In-2)調控的土壤中，與同化途徑相關的烯酰水合酶(K01692)、底物結合蛋白(K02035)以及轉運系統ATP結合蛋白(K09687)系統代謝通路相關的功能基因相對豐度高，是響應上述調控變化最為敏感的氮循環途徑。第四，與常規施肥(處理FT)相比，5 a間，減量施肥(處理OPT)和增施DCD(處理In-1)的肥料偏生產力分別提升了32.1%～38.2%和17.8%～21.9%。綜上所述，在華北集約化設施菜田石灰性褐土中，增施硝化抑制劑和肥料減施可有效減少農田氮源氣體排放，會顯著抑制氨氧化古菌AOA的數量，顯著提高肥料利用率，可有效防控農業面源污染。