關于組織缺氧檢測方法的研究進展

趙曉露，魏福蘭

氧氣的供應和擴散對細胞和組織的生存是必要的。氧分壓是器官生理狀態的關鍵組成部分。在哺乳動物中，氧氣是通過血液循環中的紅細胞所攜帶的血紅蛋白運輸的。氧氣輸送取決于每個器官的代謝要求和功能狀態，在諸如癌癥、糖尿病、冠心病、中風等病理狀態下，組織的氧合作用受到嚴重干擾，這與氧分壓的降低有關，即“缺氧”[1]。缺氧定義為氧氣的供應或輸送不足以滿足組織需求的狀態[2]。細胞供氧不足會引起細胞應激，因此在這種壓力下，細胞通常會激活細胞凋亡(程序性細胞死亡)。組織缺氧是許多疾病的標志，實體瘤[3]、心臟缺血[4]及糖尿病性視網膜病變[5]，都以缺氧為表征。同時組織缺氧在發育中起著關鍵作用，在器官發生過程中，胚胎處于部分缺氧的狀態[6]。在正畸牙齒移動過程中，牙周組織也處于缺氧的環境中[7]。因此，對低氧環境進行可視化檢測對于更好地理解其在生理學和病理學中的作用至關重要。在這篇綜述中，我們將介紹一系列用于評估組織氧含量的方法。

1 極譜氧電極

該反應中的氧分子非常重要，溶解的氧在陰極被還原隨之產生電流，因此電流取決于氧分子的存在。在組織低氧區域的電流遠低于高氧區域的電流，所以具有高靈敏度的微電極可用于測量組織中的氧含量，在各種實驗和對腫瘤的缺氧檢測中此方法是有效的。曾被廣泛用于評估頭頸部腫瘤[10]、宮頸癌[11]和前列腺癌[12]中的氧含量。但此方法適用于比較淺表的腫瘤，僅能反應組織及腫瘤局部缺氧的情況，且創傷性比較大，在穿刺過程中存在一定的腫瘤轉移風險。因存在這些不足之處，目前該檢測方法在臨床上運用較少。

2 近紅外線光譜成像

近紅外光譜成像(near-infrared spectroscopy,NIRS)是一種適用于全身各處肌肉組織和腦組織血氧含量檢測的方法,也是目前進行組織血氧含量監測廣泛應用的方法。它是一種非侵入性、動態監測局部組織氧含量的方法，在臨床上主要應用于局部腦組織氧含量的監測上,尤其在早產兒的臨床常規護理中得到廣泛應用[13]。

NIRS是一種非侵入性的光學技術，依賴于生物組織對近紅外光具有一定的透明度，運用光的透射和吸收原理，因氧合血紅蛋白和血紅蛋白具有不同的光吸收光譜[14]，可以通過測量血紅蛋白飽和度研究組織氧合的動態變化[15]。近紅外光譜中700～1 000 nm波長區段的近紅外光對人體組織具有良好的穿透性，在此波段內NIRS信號是通過脈管系統(微動脈、毛細血管和微靜脈)中的血紅蛋白吸收光而獲得的。它的主要優點是能夠進行實時及重復性測量、無侵入性，同時它的便攜式測量儀可監測人體在各種運動條件下的氧含量，使病患有較好的就醫體驗[16]。

3 血氧水平依賴磁共振成像

血氧水平依賴磁共振成像(blood oxygenation level dependent magnetic resonance imaging, BOLD-MRI)是一種可非侵入性、較為動態直觀地反映組織氧含量的方法，有助于評價腦組織及腫瘤組織內部血管的缺氧狀況，對氧氣的供應情況，血管的舒張收縮及血液流量、流速、血細胞內氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的比例改變具有一定的敏感性[17]。

BOLD-MRI可檢測紅細胞周圍的磁場變化，該變化由血紅蛋白的氧狀態決定[18]。它使用血紅蛋白作為內源性造影劑，氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白具有不同的磁性，完全氧化的血紅蛋白是反磁性的，而脫氧的血紅蛋白是順磁性的。順磁性的脫氧血紅蛋白作為對比劑，其信號強度與脫氧血紅蛋白含量密切相關，所以氧飽和度的變化會引起局部磁場敏感性的變化，這些會影響弛豫時間，并且可以通過MRI進行檢測。BOLD-MRI的優點是作為一種非侵入性技術，可根據需要重復進行，會極大地減少患者在臨床操作中的痛苦，而且相比其他放射性檢測方法比較便宜[19]。

根據BOLD-MRI的成像原理，BOLD-MRI并非直接檢測腫瘤組織中的氧分壓，組織的血容量及全身血紅蛋白水平等因素均可影響測量結果。此外，由于僅測量了脫氧血紅蛋白的濃度，在某些區域總血紅蛋白濃度較高的情況下，可能結果會出現偏差[20]。

4 18氟-硝基咪唑正電子發射計算機斷層顯像

近些年，對腫瘤低氧微環境內成像示蹤劑的研究較多，最早應用也最常見的示蹤劑是18氟-硝基咪唑(18F-fluoromisonidazole,18F-FMISO，一種硝基咪唑類衍生物)[21]。其簡要原理為：腫瘤組織內的細胞處于缺氧環境中，進入細胞內的示蹤劑18F-FMISO中的硝基基團被硝基還原酶還原，與細胞內大分子物質形成共價鍵，發生不可逆性結合滯留在組織內部，18F-FMISO在缺氧組織中的滯留量與組織細胞的缺氧程度呈正相關[22]。示蹤劑18F-FMISO通過正電子發射計算機斷層顯像(positron emission tomography combined computer tomography, PET/CT),可顯示腫瘤組織的缺氧狀態。臨床研究顯示頭頸部腫瘤[23]、非小細胞肺癌(non-small-cell carcinoma，NSCLC)[24]、宮頸癌[25]等腫瘤組織對18F-FMISO的攝取量與其缺氧程度之間有較為密切的聯系。

應用該方法能夠準確、非侵入性及動態檢測組織缺氧狀況，能對極譜氧電極法檢測不到的深部組織進行氧含量評估[26]。但硝基咪唑的代謝依賴于有活性的電子傳輸酶[27]，因此在壞死組織中無法檢測氧含量。同時因該方法有一定的放射毒性，檢測的價格較昂貴，在一定程度上限制了其應用[28-29]。

5 缺氧相關標志物的檢測

由于缺氧微環境的變化，細胞代謝會發生改變，進而一些特異性標記物的含量也會發生相應的改變。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是一種在缺氧條件下穩定存在于細胞核中的轉錄因子亞基，當其與缺氧誘導因子-1β(hypoxia inducible factor-1β,HIF-1β)亞基形成異源二聚體缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)后，HIF-1可與靶基因的缺氧反應元件(hypoxia response elements，HRE)序列結合，其下游多種靶基因的表達受到影響[30]，包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)[31]、葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter-1,GLUT1)、碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9,CAIX)[32]、促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)[33]等，因此，HIF-1α在缺氧微環境中起著關鍵作用。

可以通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印跡(western blotting)以及免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)等方法對HIF-1α、VEGF、GLUT1、CAIX、EPO等基因及蛋白的表達水平進行檢測，并通過相關性分析來判定組織的缺氧程度[34]。這些檢測方法所用的樣本通常是有活性的細胞或組織，但有時會因樣本量不夠而導致結果有所偏差，因此需要進行多次獨立實驗。

6 缺氧敏感性熒光探針

熒光探針由識別基團、連接基和熒光基團三部分構成，識別基團可響應環境變化，與細胞內物質相互作用或發生特定的化學反應，激活熒光基團發出強烈的熒光，是示蹤顯像工具的重要組成部分[35]。

通常情況下，組織的缺氧程度與組織內部的還原物質，如硝基還原酶(nitroreductase,NT)和偶氮還原酶(azoreductase,AzoR)等的局部濃度密切相關。因此，基于在低氧條件下還原酶可與硝基芳香族化合物或偶氮衍生物發生還原反應，通過使用具有缺氧敏感性的硝基芳族化合物或偶氮衍生物作為識別基團，與已知的熒光基團連接已經研發了許多缺氧敏感性熒光探針。

體內硝基還原酶響應的熒光探針，是將硝基芳香族化合物基團與可以在不同波長下激發熒光的熒光基團通過化學鍵相連[36]，在體內缺氧的情況下硝基還原酶將硝基基團還原，繼而引起熒光基團釋放熒光。硝基芳香族類化合物進入缺氧細胞內，在硝基還原酶的作用下發生還原反應，與細胞內大分子物質結合，滯留在細胞內，可以通過共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞內熒光強度，或者運用紅外光譜激發成像[37]。有研究設計了2-硝基咪唑-1,8-萘二甲酰亞胺共軛物作為熒光探針，用于檢測HeLa細胞的還原性應激[38]。

體內偶氮還原酶響應的熒光探針，是由偶氮基團與熒光基團相連，偶氮還原酶是體內必不可少的還原酶，可以催化偶氮鍵(N═N)的裂解。由于偶氮基團對氨基的保護，探針本身是不發熒光的，當在缺氧的環境中，偶氮基團被還原，偶氮鍵斷裂，產生成能夠提供電子的氨基，從而導致分子內電荷轉移，使熒光基團產生強熒光信號被檢測到[39]。

缺氧敏感性熒光探針具有操作簡便、靈敏度高、可活體成像、實時觀察等優點，在檢測腫瘤細胞的缺氧狀態、監測腫瘤發展進程中有廣泛應用[40]。

7 進展與展望

低氧檢測對人體生理及病理進程有重要臨床意義，檢測結果有助于醫生更好地了解病程，把握病情。隨著組織缺氧的檢測方法被不斷探索和改進，新的研究進展使連續測量、非侵入性組織氧評估和細胞內氧評估成為可能。本文介紹的這些檢測方法都有各自的優缺點，因此，需要全面了解并選擇合理的方法來評估組織缺氧狀況，針對不同患者確定最適合的方法，來達到快速高效檢測的目的。同時，針對組織細胞的缺氧環境可加以利用，設計具有缺氧靶向性的藥物，針對局部組織用藥，靶向精準治療腫瘤等疾病，盡快研發應用于臨床，以期早日減輕病人痛苦。