超聲微泡爆破輔助骨髓間充質干細胞移植治療大鼠慢性腎病

夏春娟，王家平，楊楊，李天祎，邵麗詩，馬逸群，張婭

昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明650101

慢性腎病（CKD）是一種慢性疾病，臨床表現為蛋白尿、腎小球濾過率正常或降低，以及進行性腎小球、腎小管和間質損害［1］。CKD的特征在于腎功能的進行性喪失，導致終末期腎臟疾病和膠原蛋白的積累，引起的炎癥，導致腎臟纖維化［2］。目前針對CKD患者采用藥物、透析或腎臟移植等方式治療，盡管可以改善整體腎臟功能，但不能促進周圍組織再生和功能恢復［3］。近年來，骨髓間充質干細胞（BMSC）移植已廣泛應用于各類型腎病的治療，BM?SC能分化成腎臟細胞和血管組織，實現受損腎臟細胞再生，從而改善腎臟功能［4］。盡管大量研究證實干細胞對各類腎臟疾病治療具有有效性，但其歸巢率和存活率低仍限制著其對靶器官充分發揮作用，因此促進干細胞向靶器官歸巢是治療的關鍵。超聲造影劑是一種含直徑0.5～10μm氣泡的液體，含有的微氣泡由于破壞后產生空化效應、生物學效應等，因此可提高藥物靶向和基因治療［5］。本研究基于經腎動脈移植BMSC基礎上加入超聲微泡，觀察兩者聯合治療大鼠CKD的療效，旨在探索安全有效的方法來提高BMSC歸巢率，從而更有效的發揮對CKD腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物18周齡健康雄性SD大鼠44只，清潔級（由昆明醫科大學實驗動物中心提供），體質量150～180 g；選取34只用于構建CKD動物模型，10只為正常對照。另選4周齡健康雄性SD大鼠2只，體質量100 g，為BMSC供體。

1.2 BMSC制備 選4周齡SD大鼠2只，脫頸處死，75%乙醇全身浸泡10 min，生理鹽水沖洗干凈，嚴格按無菌操作分別取雙側脛骨、股骨，骨髓腔充分暴露，5 mL注射器抽取磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗骨髓腔3～4次，骨髓腔沖洗液收集后混勻、過濾、離心，用10%胎牛血清（美國Gibco公司）、含1%青鏈霉素雙抗（美國Gibco公司）L-DMEM培養基重懸細胞，隨后接種至T25細胞培養皿中，置于細胞培養箱中孵育，2 d后首次換液，之后依次間隔3 d換液，待細胞生長融合90%～100%時用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索萊寶科技公司）消化細胞，P3代細胞培養行成脂、成骨誘導分化，流式細胞儀（德國Beckman coulter公司）檢測細胞表面抗原CD45、CD90。倒置相差顯微鏡下見BMSC間有一定黏附性，呈長梭形、多邊形、“渦狀”貼壁生長。成脂誘導培養2周末油紅O染色，可見染成紅色的脂肪細胞；成骨誘導培養4周末茜素紅染色，可見細胞質內鈣結節被染成橘紅色（證明骨髓間充質干細胞具有多向分化潛能）。P3代BMSC表面抗原CD45表達率為11.5%、CD90表達率為99.96%（鑒定骨髓間充質干細胞）。

1.3 超聲微泡制備 將超聲微泡造影劑（聲諾維造影劑，意大利Braco公司）按照說明書配置成混懸液，即在裝有造影劑的小瓶里注入0.9%生理鹽水5 mL，然后用力振搖瓶子，直至凍干粉末完全分散，微泡濃度為2×108個/mL，平均直徑為2.5μm（配置標準超聲微泡劑量）。

1.4 CKD模型制備及超聲微泡爆破輔助骨髓間充質干細胞移植治療方法 選取18周齡SD大鼠34只，自由飲水、飲食適應性喂養1周。固定后經尾靜注阿霉素3 mg/kg（美國Sigma公司），14 d時再次注射相同劑量阿霉素。之后每周經尾靜脈采血，平均為7周，以血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）和24 h尿蛋白水平升高，且病理切片行HE染色示CKD改變為造模成功標準［6］。造模實驗過程中死亡1只，造模后飼養期間死亡3只，最終30只制模成功并納入后續實驗。30只CKD大鼠隨機分為BMSC+微泡組、BMSC組、CKD組各10只，造模7周末各組開始同時治療。各組大鼠均以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，無菌手術臺固定，暴露腹部，脫毛，碘伏消毒，鋪無菌手術單，切開皮膚，逐層分離至顯示腎動脈。BMSC+微泡組：經腎動脈注射0.5 mL的BMSC（2×106/mL），緊接著注入0.5 mL的聲諾維造影劑（2×108個/mL），注射完畢后立即啟動西門子S3000超聲診斷儀（美國西門子醫療系統公司），采用9L4高頻線陣探頭配備造影模式：傳輸頻率為7.5 MHz，機械指數0.04，每隔10 s對兩側腎臟分別爆破1次，共3次。BMSC組：經腎動脈注射0.5 mL的BMSC（2×106/mL）懸液。對照組及CKD組：經腎動脈輸注等量0.9%氯化鈉溶液。術畢，逐層縫合大鼠腹部切口，切口處及肌內分別注射抗生素抗感染，置入飼養籠保溫、飼養。

1.5 尿蛋白及血清BUN、Cr檢測和腎臟病理評估 ①尿蛋白及血清BUN、Cr檢測方法：造模第8周，將各組大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液，存儲在-70℃冰箱。經腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），待完全處于麻醉狀態下，經尾靜脈采血，使用自動生化分析儀（日立7170型，日本）檢測尿蛋白及血清BUN、Cr。治療1周后，將各組大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液，經尾靜脈采血，使用自動生化分析儀檢測尿蛋白及血清BUN、Cr。治療2周后，將各組大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液。第2天依次經腹腔注射10%水合氯醛，待完全處于麻醉狀態下，使用一次性靜脈采血針穿刺心臟采血后，一部分將血液樣品收集到血清收集凝膠管中放置室溫1 h進行凝結，然后將樣品以3 500 r/min離心15 min分離血清，使用自動生化分析儀檢測尿蛋白及血清BUN、Cr。②腎臟病理評估方法：緊接著灌注后立即取出各組腎臟組織，固定在10%甲醛中，選取部分腎皮質（1 mm×1 mm×1 mm）組織放入多聚甲醇溶液中。經過固定、脫水、包埋、制作石蠟切片，HE、Masson染色后，在光學顯微鏡下（日本Nikon公司）由3名不同病理科醫生觀察并描述，纖維化評分依病變由輕至重的程度，陰性記0分，少量記1分，中等量記2分，多量記3分，大量記4分。

1.6 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計量資料以±s表示，治療前后比較采用配對T檢驗，采用方差分析行多組間比較，兩兩比較采用L-LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組治療前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比較 治療前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比較見表1。

表1 各組治療前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比較（±s）

表1 各組治療前后血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平比較（±s）

注：與同組治療前比較，aP＜0.05；與對照組比較，bP＜0.05；與CKD組比較，cP＜0.05；與BMSC組比較，dP＜0.05。

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2.2 各組腎臟組織病理變化比較 對照組HE染色顯示腎小球及腎小管正常、基底膜未見增生、未見炎性細胞；Masson三色染色未見染色膠原纖維，評分為0分。CKD組HE染色顯示腎小球囊擴張、腎小球內見大量空泡、部分腎小管萎縮、基底膜不同程度增生、間質部炎性細胞大量分布；Masson三色染色顯示腎小管間質周圍大量藍色著染膠原纖維，評分為4分。BMSC組HE染色顯示少量腎小球囊擴張、腎小球內見少量空泡、少量腎小管萎縮、部分腎小管管型、基底膜增生程度減少、間質炎性細胞分布減少；Masson三色染色顯示腎小管間質周圍少量藍色著染膠原纖維，評分為2分。BMSC+微泡組HE染色顯示極少量腎小球囊擴張、腎小球內見極少量空泡、極少量腎小管萎縮及腎小管管型、基底膜增生程度減少、間質炎性細胞分布明顯減少；Masson三色染色顯示腎小管間質周圍極少量藍色著染膠原維，評分為1分。詳見圖1。

3 討論

阿霉素是一種蒽環類抗生素，廣泛應用于多種腫瘤治療，其主要不良反應是引起心臟和腎臟毒性。阿霉素誘導的腎損傷性腎病是公認的嚙齒動物模型，目前大量應用于腎臟疾病進展機制、治療方法等研究［7］。阿霉素引起的腎毒性其機制復雜，病理上主要表現為腎小球破壞和腎小管間質損害導致腎小管間質纖維化和腎小球硬化［8］，主要表現為嚴重的蛋白尿，血尿和水腫。以往治療阿霉素腎病主要采取藥物、透析或者腎移植［9］，但其治療費用昂貴且無法逆轉腎臟修復，因此治療受到限制。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色和Masson三色染色病理圖片（×400）

BMSC是一類在特定條件下具有自我更新和多能分化潛能的細胞群。國內外實驗研究表明，BMSC通過促進分泌細胞生長的因子、細胞旁分泌、細胞外囊泡分泌等機制為BMSC細胞移植營造良好的微環境，從而抑制炎癥反應、引發組織再生、促進血管生成［10］。隨著研究的不斷深入，證實BMSC在各類型腎臟疾病治療中取得較好的效果［11］。BMSC移植治療CKD受影響因素頗多，包括體內受環境、免疫、代謝等［12］。體外細胞增殖、定向歸巢能力、移植過程中細胞數量及次數不同等，均會造成BMSC衰老、凋亡甚至死亡，影響治療效果。目前提高BMSC的移植成功率是研究熱點，包括不同移植途徑、移植次數、基因修飾，細胞表面工程和體外誘導等方式［13］，其中移植方式的選擇很大程度影響移植成功率。超聲微泡在受到機械波的作用下產生爆破后發射微射流，細胞膜上鈣、鈉離子等通道開放，周圍毛細血管通透性增加，使得BMSC更有效地進入靶器官和組織。同時通過改變細胞周圍微環境促進內分泌因子分泌，有利于干細胞向靶器官的歸巢［14］。由于超聲微泡爆破作用于靶器官時間短暫因此對BMSC的增殖和存活沒有影響［15］。因此，本研究采取以往前期研究團隊的移植方式即經腎動脈移植［16］基礎上加入超聲微泡爆破以觀察其療效。

本研究通過BMSC組、BMSC+微泡組與CKD組比較，BMSC組24 h尿蛋白；BMSC+微泡組24 h尿蛋白、血清Cr、血清BUN移植第2周末降低明顯，HE提示兩組均腎小球囊部分擴張、腎小球內空泡減少、部分腎小管擴張、基底膜增生不同程度減少、間質炎性細胞浸潤有所減少。Masson三色染色顯示腎小管間質周圍膠原纖維減少，證明BMSC可使部分受損腎組織修復。研究［17］表明，BMSC通過減輕炎癥反應、增強對受損組織的修復能力等來減輕或逆轉CKD腎臟受損程度相符。本研究還顯示，BMSC+微泡組與BMSC組比較24 h尿蛋白、血清Cr、血清BUN降低；且較CKD組降低明顯，HE染色及Masson三色染色顯示CKD病理改變較BMSC組改善明顯。證明超聲微泡聯合BMSC移植，能更有效的減輕纖維化及恢復部分結構，促進大鼠CKD腎臟其功能恢復。這與部分研究認為超聲介導的微泡促使BMSC相應組織或器官修復，從而改善相應功能相符［18］。研究［19］發現，超聲介導的微泡對急性心肌梗死大鼠受損心肌可起到修復作用。研究［20］證明，超聲微泡介導的BMSC可以通過抑制炎癥、減少腫瘤壞死因子-α及白細胞介素-1β表達進而治療大鼠前列腺炎。超聲微泡爆破聯合BMSC移植促進修復大鼠CKD腎臟的機制可能為：①超聲微泡爆破后會引起腎微血管短暫炎性信號反應吸引更多BMSC向腎臟歸巢；②超聲微泡爆破后瞬時產生流體微噴、沖擊波和空化效應，作用于細胞膜上產生剪切應力，從而破壞血管內皮細胞內膜、內皮細胞短暫收縮、間隙增寬并增加血管通透性，促使BMSC在腎微血管里聚集、循環增多［21］；③超聲微泡爆破后可能引起腎臟微環境改變，某些生長因子或細胞因子表達增加，如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6，這些因素均吸引BMSC向腎臟區域歸巢，促進腎臟局部血管生成及減少纖維化；④超聲微泡爆破后導致靶向區域腎細胞內、外熱力學改變、能量聚集、代謝增強，有利于BMSC分化、增殖。

總之，超聲微泡爆破聯合BMSC移植治療大鼠CKD效果較好，其可減輕大鼠CKD腎臟損傷程度，改善腎臟功能。