紫癜性腎炎患兒血清sFlt-1、vWF水平變化及其意義

代彥林，張霞，高敏，韓姍姍，，丁櫻，

1河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州450000；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

紫癜性腎炎（HSPN）是最常見的繼發(fā)性腎小球疾病，是影響過敏性紫癜（HSP）患兒病程及預(yù)后的重要因素［1-2］。HSPN臨床表現(xiàn)多樣，可表現(xiàn)為急進(jìn)性腎炎、急性腎炎、腎病綜合征、急性腎功能損傷等多種類型，腎臟病理表現(xiàn)為以IgA系膜區(qū)沉積為主的系膜增生性腎小球腎炎［3］。HSPN是自限性疾病，以往認(rèn)為患者預(yù)后良好，但長期隨訪發(fā)現(xiàn)3%～7%的患兒數(shù)年后發(fā)生更嚴(yán)重的腎損害，甚至進(jìn)展為終末期腎病［4］，嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量，威脅患兒生命健康。HSPN生理、病理過程復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，目前普遍認(rèn)可的是異常糖基化的IgA1，IgA1形成的免疫復(fù)合物沉積于機(jī)體小血管壁，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)、凝血途徑、炎癥反應(yīng)等引起小血管壁損傷［5］。費(fèi)文君等［6］發(fā)現(xiàn)，用熱聚合的HSP患者血清中IgA1刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞12 h，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞IL-8、TNF-α、NO釋放以及NF-κB表達(dá)，從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞。故而內(nèi)皮損傷在HSPN的發(fā)病及進(jìn)展中有重要意義，及時(shí)了解內(nèi)皮損傷程度，并做出對應(yīng)處理，在減緩HSPN疾病進(jìn)展中有積極作用。可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1（sFlt-1）作為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的可溶性抗體［7］，能夠結(jié)合VEGF，拮抗其營養(yǎng)功能引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的重要因子。vWF是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的一種具有黏附功能的大分子糖蛋白，主要功能是介導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷后的初始血小板黏附、聚集。內(nèi)皮細(xì)胞損傷、異常活化時(shí)vWF在30 min內(nèi)快速釋放入血，因此vWF被作為內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物［8］。本研究觀察了HSPN患兒血清中sFlt-1、vWF的水平變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年4月—2019年4月河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的HSPN患兒45例，男30例，女15例；年齡4～17（9.36±3.00）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HSPN臨床診斷符合《紫癜性腎炎的診治循證指南（2016）》的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，且臨床分型符合血尿和蛋白尿型或者孤立性蛋白尿型；②年齡2～18歲；③1周≤HSPN病程≤8周；④針對尿檢異常未使用過腎上腺皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、雷公藤多苷、霉酚酸酯等免疫抑制劑；⑤患兒或其監(jiān)護(hù)人同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①除HSP外其他疾病導(dǎo)致的腎臟損傷；②持續(xù)高血壓或腎氮質(zhì)血癥者；③系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎、病毒性肝炎（丙肝、乙肝等）、高尿酸血癥等所致的腎損害；④對本方案中藥物成分過敏者；⑤不符合以上西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床類型屬孤立性蛋白尿或血尿和蛋白尿型以外類型。另選同期收治的HSP患兒15例，男10例，女5例；年齡6～16（10.22±2.32）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2013年《兒童過敏性紫癜循證診治建議》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②年齡在2～18歲；③未使用昆仙膠囊及雷公藤多苷片等免疫抑制劑）；④無腎臟損傷表現(xiàn)（血尿、蛋白尿）。同期健康體檢兒童15例，男9例，女6例；年齡5～15（10.31±2.14）歲。納入對象一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批，且所有兒童及其監(jiān)護(hù)人已同意并簽署知情同意書。

1.2 血清sFlt-1、vWF檢測方法 經(jīng)患兒及監(jiān)護(hù)人同意，由護(hù)士抽取HSPN患兒、HSP患兒、健康體檢兒童晨起空腹靜脈血3 m至無菌抗凝管中，室溫靜置30 min后以3 000 r/min離心5 min，于EP管分裝后置于－80℃冰箱冷存?zhèn)溆茫瑫r(shí)收集記錄HSPN患兒的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料。嚴(yán)格按照試劑盒說明書，用ELISA法同批檢測所有血清樣本sFlt-1、vWF水平。在sFlt-1、vWF細(xì)胞檢測板中加入對應(yīng)濃度的待測品（稀釋30倍）和標(biāo)準(zhǔn)對照品，加入酶標(biāo)試劑，封板膜封板后置37℃恒溫箱孵育30 min，洗板5次后依次加入相應(yīng)的顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后利用終止劑對反應(yīng)進(jìn)行終止，并利用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測出各孔OD值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并計(jì)算出兩細(xì)胞因子的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清sFlt-1、vWF水平比較 血清sFlt-1、vWF水平比較見表1。

表1 各組血清sFlt-1、vWF水平比較（±s）

表1 各組血清sFlt-1、vWF水平比較（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05；與HSP組比較，▲P＜0.05。

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2.2 HSPN組血清sFlt-1與vWF水平的相關(guān)性HSPN組血清sFlt-1與vWF水平無相關(guān)性（r=-0.24，P=0.180）。

3 討論

HSPN是兒童常見的一種繼發(fā)于HSP的腎小球疾病，發(fā)病誘因涉及感染、藥物反應(yīng)、免疫紊亂［9-10］等，其發(fā)病機(jī)制尚未有統(tǒng)一定論，目前公認(rèn)的是IgA異常糖基化形成的免疫復(fù)合物沉積于機(jī)體小血管壁，尤其是腎毛細(xì)血管叢而引起一系列炎性反應(yīng)造成小血管壁損傷［5］。當(dāng)機(jī)體對沉積于血管壁上的免疫復(fù)合物出現(xiàn)清除障礙時(shí)，可通過血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）主動轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及巨噬細(xì)胞對Fc受體依賴的攝取功能，使IgA1形成的免疫復(fù)合物沉積于腎小球毛細(xì)血管叢，引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（EC）損傷［11-12］，進(jìn)而出現(xiàn)血尿、蛋白尿等HSPN的典型癥狀；EC損傷，組織因子暴露于血液并與FVII或FVIIa結(jié)合，進(jìn)而激活凝血系統(tǒng)，損傷的EC可釋放Ⅷ因子相關(guān)抗原促進(jìn)血小板黏附于血管內(nèi)膜，導(dǎo)致腎小球局部微循環(huán)內(nèi)凝血，加重小球內(nèi)纖維蛋白沉積、微血栓形成，腎血流減少，則進(jìn)一步加重腎損害，在腎臟活檢中常發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管內(nèi)血栓形成以及纖維蛋白沉著。祝旭飛等［13］發(fā)現(xiàn)，根據(jù)血管內(nèi)皮病變情況進(jìn)行腎臟病理分類，能夠更準(zhǔn)確地反映HPSN患者腎臟損傷程度，及早提示腎小球病變。

sFlt-1是由Flt-1蛋白的胞外前6個(gè)結(jié)構(gòu)域加上1個(gè)特異性31氨基酸尾部組成，主要在內(nèi)皮細(xì)胞、近端腎小管細(xì)胞、胎盤等部位分泌，以游離形式存在，可通過結(jié)合VEGF，拮抗其營養(yǎng)功能而引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷。sFlt-1由Flt-1胞外域剪接而成，與VEGF有高親和力特性，并且能與VEGF的兩個(gè)表面受體VEGFR-1、VEGFR-2形成同源或異源二聚體，從而阻斷VEGF的生物學(xué)活性，抑制其促有絲分裂作用，sFlt-1的拮抗作用幾乎能夠全部抑制VEGF引起的內(nèi)皮細(xì)胞增殖活動，從而導(dǎo)致血管生成障礙以及影響血管壁的完整性和通透性［14］。FAILLA等［15］發(fā)現(xiàn)，sFlt-1能夠破壞血管生成平衡機(jī)制，降低血管生成活性，損傷血管的修復(fù)機(jī)制，從而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷以及蛋白尿的排出。SUGIMOTO等［16］給予正常小鼠sFlt-1，3 h后可出現(xiàn)明顯的蛋白尿，24 h內(nèi)觀察到腎臟病理出現(xiàn)一系列的改變，包括內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、細(xì)胞內(nèi)空泡形成與裂解，臟層上皮細(xì)胞的損害和脫落，內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜分離等。WEWERS等［17］發(fā)現(xiàn)，在腎移植4個(gè)月內(nèi)接受腎活檢的25例參與者中，血清sFtl-1水平升高患者腎小管周毛細(xì)血管面積較小。將重組sFlt-1注入嚙齒動物中會導(dǎo)致腎臟微血管的結(jié)構(gòu)以及功能變化，包括腎小管周圍毛細(xì)血管密度降低，毛細(xì)血管內(nèi)血容量減少，炎癥基因表達(dá)增加，以及腎小球纖維化增加。因此，sFlt-1作為VEGF的可溶性受體是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要因子之一。

vWF是由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成的一種大分子蛋白多聚體，其絕大部分是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，在靜息狀態(tài)下以二硫鍵相連的多聚體形式儲存在內(nèi)皮細(xì)胞的棒管狀小體（WPB）中，生理狀態(tài)下血漿中vWF的含量較少，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、異常活化時(shí)，vWF可以在30 min內(nèi)被釋放入血液循環(huán)，快速吸附至損傷位點(diǎn)，通過多種分子機(jī)制促使血小板黏附于損傷的內(nèi)皮下層，誘導(dǎo)血小板進(jìn)一步聚集和黏附［18-19］，隨后更多的血小板聚集，逐漸形成血栓，沉積于毛細(xì)血管，引起局部組織缺血和低灌注。vWF的產(chǎn)生幾乎全部來自于血管內(nèi)皮細(xì)胞，其變化能夠敏感反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷、異常活化以及功能障礙等，是目前公認(rèn)的有價(jià)值的內(nèi)皮損傷標(biāo)志［20］。MEIR?ING等［21］用IL-6、IL-8、TNF-α、組織因子（TF）、凝血酶刺激療HUVEC，靜態(tài)條件下觀測24 h，發(fā)現(xiàn)除了IL-6，其他因子及它們的組合均能顯著刺激HUVEC的vWF的分泌。劉沨等［22］對62例HSPN患者血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)HSPN患者血清vWF水平高于對照組，且與蛋白尿水平以及腫瘤壞死因子相關(guān)。綜上，血清sFlt-1、vWF血管活性物質(zhì)的檢測可以比較敏感地反映血管內(nèi)皮的病變，能夠一定程度上反映內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

本研究顯示，HSPN患兒血清sFlt-1、vWF水平明顯高于HSP患兒及健康體檢兒童，HSP組患兒血清sFlt-1、vWF的水平高于對照組兒童，提示sFlt-1、vWF可能參與了HSPN的發(fā)病進(jìn)程，且導(dǎo)致或加重HSP以及HSPN中內(nèi)皮損傷［22］。本研究還發(fā)現(xiàn)，HSPN患兒血清sFlt-1水平與vWF水平無相關(guān)性，目前在HSPN方面尚無此類研究，所以無法進(jìn)行比較驗(yàn)證，由于IgAN和HSPN具有相似的腎臟病理表現(xiàn)和免疫學(xué)改變，目前被多數(shù)專家認(rèn)為是同一種疾病的不同表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，IgAN患者血清sFlt-1與vWF呈正相關(guān)，這與本研究結(jié)果不一致，我們考慮以下幾點(diǎn)原因：①HSPN與IgAN發(fā)病機(jī)制并非完全相同，HSPN中除外內(nèi)皮生成、破壞不平衡外，尚有其他機(jī)制存在，具體機(jī)制尚需要我們進(jìn)一步去探索；②研究對象不同，本項(xiàng)研究中所有研究對象均為兒童，而ZHAI等的研究對象為成年人；③樣本量過少，本次實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間以及病例要求的嚴(yán)格性，只納入了45例合格病例。

總之，HSPN患兒血清sFlt-1、vWF水平升高，兩者可能參與HSP早期腎臟損傷。