長相思葡萄生長發育過程中理化指標及氨基酸含量分析

陳華偉，樂小鳳，張振文，2*

（1.西北農林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

游離氨基酸是果實中的重要營養物質和相關風味物質的合成前體，對香蕉、蘋果、番茄、草莓和甜瓜等果實的研究均表明相關氨基酸作為重要前體參與了支鏈酯類的合成[1-7]。一些氨基酸先通過轉氨作用形成支鏈酮酸，然后經脫氫或脫羧形成酰基輔酶A和支鏈醇，再經過醇脫氫酶和醇酰基轉移酶的催化進而形成支鏈酯類物質[8]。葡萄中的氨基酸占含氮化合物的25%～30%，在釀造葡萄酒過程中作為酵母的主要氮源，為葡萄酒的發酵香氣（主要是酯類物質和高級醇）提供底物，也是微生物合成氨基甲酸乙酯和生物胺的前體物[9]，其含量的高低是發酵調控葡萄酒質量與安全的重要指標。半胱氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、色氨酸、亮氨酸和酪氨酸主要參與葡萄酒中高級醇的合成；參與葡萄酒中褚曲霉素A合成的是苯丙氨酸；鳥氨酸、精氨酸、色氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和絲氨酸分別對應合成葡萄酒中的腐胺、精胺、羥色胺、半胱胺、酪胺、組胺、苯乙胺、尸胺和乙醇胺[9-10]。氨基酸的生物合成途徑各異，但共有的碳骨架主要來源于糖酵解、檸檬酸循環和戌糖磷酸等代謝途徑的中間產物[11]。天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸在發酵時可優先被釀酒酵母所利用；纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和異亮氨酸在葡萄酒釀造過程中可相應地轉化為異丁醇、丙醇、異戊醇和活性戊醇，這些高級醇也可進一步形成高級醇醋酸酯，這些酯類和醇類物質是酒中主要的發酵香成分；脯氨酸是一種植物相容滲透劑，有利于抵御滲透脅迫[12-13]。釀酒酵母的氨基酸代謝對酒的風味品質有重要影響，產生的主要發酵香氣物質包括支鏈酸、乙酸酯、高級醇、脂肪酸乙酯以及揮發性硫化物等[14]。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸作為前體物質可以通過莽草酸途徑合成揮發性醚類、酚類以及酯類物質[15]。異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸可能是葡萄中重要的品種香氣物質甲氧基吡嗪的合成底物，是釀酒葡萄果實中典型的青椒味香氣特征化合物，很大程度上影響了葡萄酒的風味[16]。劉沛通等[17]的實驗結果表明，添加支鏈氨基酸可以促進酵母細胞的生長和發酵速率，提高了酒中脂肪酸乙酯類物質含量，改善了葡萄酒的香氣品質。GUTIéRREZ A等[18]研究表明，外源添加精氨酸可促進酯類物質的合成。氨基酸濃度影響葡萄酒的香氣品質，蘇氨酸含量越高，酒中苯乙醇和異戊醇含量較高[19]。王亞欽[14]在模擬汁中添加支鏈氨基酸，結果發現酒中的乙酸苯乙酯、2-苯乙醇和脂肪酸的含量增加，添加較高濃度支鏈氨基酸更有利于葡萄酒香氣物質積累。ITAY M等[20]研究發現，外源亮氨酸和苯丙氨酸促進了玫瑰香葡中醛類和醇類的合成，如3-甲基乙酸丁酯和2-苯乙酸含量顯著增加。

由于果實中氨基酸與葡萄酒香氣的密切關系，本試驗從盛花期后40 d開始，對長相思葡萄果實發育過程中氨基酸成分的變化進行測定分析，以期了解這些組分在長相思葡萄生長發育過程中的變化規律，把握氨基酸組分形成的關鍵時期，為后期葡萄品質調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長相思葡萄（VitisviniferaSauvignon Blanc）自根苗：寧夏銀川的張裕摩塞爾酒莊，定植于2011年，行距為2.0 m×2.8 m，斜拉“廠”字形單籬架，南北行向，進行常規田間管理。

鹽酸、甲酸、碳酸鈉、甲基纖維素、硫酸銨、十二水合磷酸氫二鈉、甲醇、乙腈（均為分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、氨基丁酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸和脯氨酸標準品（純度均＞99%）：日本Shimadzu公司；葡萄糖、果糖、酒石酸、檸檬酸和蘋果酸標準品（純度均＞99%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

PAL-1數字手持折糖儀：日本愛拓公司；AUW220D電子天平、LC-2030型島津高效液相色譜儀、AJS-02色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）：日本島津公司；GL-20G-H 型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；LE438p H計：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

2017年，葡萄漿果從盛花期后40 d開始采集，約每10天采一次樣，直至成熟（花后105 d），共采樣7次。每次上午10點隨機采集樣品約800粒，生物學重復3次，液氮速凍后置于-40 ℃冰箱。

1.3.2 基本理化指標的測定

隨機選取100粒果實用于測定百粒質量、可溶性固形物、可滴定酸含量和pH值，均重復3次。百粒質量采用分析天平進行稱量；可溶性固形物、可滴定酸含量和pH值分別用手持糖度計、NaOH滴定法和pH計測定[21]；同時隨機選取150粒用于長相思葡萄果皮中總酚和單寧含量的測定[22]。

1.3.3 果實氨基酸的測定

氨基酸的測定：參考YUE X F等[23]的方法。每個處理隨機取100粒果實，在液氮環境下去籽后磨粉，將粉末收集于50 mL離心管中，4 ℃浸漬4 h后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，用0.45 μm的尼龍膜過濾葡萄汁，取100 μL過濾后的葡萄汁與50 μL內標液、400 μL 0.1 mol/L HCl混合。分離柱為AJS-02（4.6 mm×150 mm，3 μm）色譜柱，柱溫45 ℃。洗脫液A：2 000 mL鹽酸緩沖液（pH 8.2），9.0 g磷酸氫二鈉十二水合物和9.5 g四硼酸鈉十水合物；洗脫液B：水，乙腈和甲醇（10∶45∶45，V/V）。氨基酸的定性和定量參照OLIVA J等[24]的方法，主要根據外標和保留時間進行的，每樣品重復測定3次，取平均值。

1.3.4 數據分析

試驗數據采用SPSS19.0軟件進行統計分析，使用Duncan’s差異顯著性分析，顯著水平P＜0.05。用Excel 2016軟件制作圖表。

2 結果與分析

2.1 長相思葡萄生長發育過程中基本理化指標的變化

長相思葡萄生長發育過程中可溶性固形物、可滴定酸含量、pH值、百粒質量、總酚和單寧的變化趨勢見表1。由表1可知，葡萄漿果的可溶性固形物在花后40～50 d緩慢增長，花后50～60 d急劇增長，花后60～105 d增長緩慢；從花后40 d到成熟，葡萄漿果的可溶性固形物由5.05°Bx增長至22.25°Bx。可滴定酸含量在花后40～50 d緩慢下降，花后50～70 d迅速下降，花后70～105 d下降緩慢；可滴定酸含量由35.69 g/L下降至6.25 g/L。果實pH值呈緩慢上升的趨勢，和可滴定酸含量下降的趨勢基本相同，由2.71上升至3.94。葡萄漿果百粒質量的變化趨勢與可溶性固形物含量變化趨勢一致，花后40～105 d，葡萄漿果的百粒質量由83.77 g增長至204.88 g。葡萄漿果發育過程中總酚含量從花后40～90 d呈下降趨勢，成熟時含量趨于穩定；從花后40 d到成熟，總酚含量由41.68 mg/g 下降至14.53 mg/g。漿果的單寧含量在花后40～60 d迅速下降，花后60～70 d含量略微回升，花后70～105 d含量持續下降；從花后40 d到成熟，單寧含量由28.87 mg/g下降至1.38 mg/g。

表1 長相思葡萄生長發育過程中基本理化指標的變化Table 1 Changes of basic physical and chemical indicators during the growth and development process of Sauvignon Blanc

2.2 長相思葡萄生長發育過程中氨基酸含量的變化

長相思葡萄生長發育過程中的氨基酸含量變化見表2。由表2可知，共檢測到16種氨基酸。16種氨基酸在長相思葡萄生長發育過程中主要呈4種變化趨勢：胱氨酸從花后40 d到花后90 d呈緩慢下降趨勢，在成熟時增長至130.52 mg/L。亮氨酸是葡萄酒發酵香氣物質的主要底物，其在葡萄中的含量對酒中高級醇、酸及相應酯類物質的合成具有重要影響。其在葡萄漿果生長發育過程中呈增長趨勢，從花后40 d的67.77 mg/L增長至花后105 d的336.75 mg/L。甲硫氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、異亮氨酸和賴氨酸的含量在發育過程中變化不大，保持相對穩定；其余9種氨基酸的含量從花后40 d到花后90 d呈增長趨勢，成熟時含量下降。精氨酸通常是葡萄果實中含量最高的氨基酸，也是葡萄中氮的主要儲存形式，前人研究表明精氨酸在赤霞珠葡萄果實轉色期時大量積累，在成熟前有小幅度的降低；脯氨酸是一種植物相容滲透劑，可以提高釀酒酵母細胞對乙醇的耐受性，脯氨酸含量也比較高但不能被釀酒酵母同化吸收，所以精氨酸與脯氨酸含量的比例通常用來衡量葡萄的可同化氮狀況，比值越高則酵母可利用氮源比例越高[25]。精氨酸與脯氨酸含量比值的變化情況可知，精氨酸與脯氨酸含量的比值從花后50 d快速增加，成熟時達到最大值（5.67），表明長相思葡萄中的酵母可利用氮源是隨著生長發育而逐漸積累的，在采收時最多。

表2 長相思葡萄生長發育過程中氨基酸含量的變化Table 2 Changes of amino acid contents during the growth and development process of Sauvignon Blanc

2.3 長相思葡萄生長發育過程中營養成分的主成分分析

用SPSS 19.0對長相思葡萄的可溶性固形物、可滴定酸、pH、百粒質量、總酚、單寧以及16種氨基酸的含量進行主成分分析。由圖1、圖2可知，第1主成分方差貢獻率為79.725%，第2主成分方差貢獻率為14.792%，累計方差貢獻率為94.518%。不同發育時期的長相思葡萄分布比較分散，花后40 d、50 d和60 d的葡萄分布在第一主成分的負方向，葡萄中總酚、單寧、可滴定酸、蘋果酸、胱氨酸和甲硫氨酸含量較高；花后70 d、80 d和90 d的葡萄分布在第一主成分和第二主成分的正方向，花后80 d和90 d的葡萄中可溶性固形物、pH、葡萄糖、果糖、γ-氨基丁酸、甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸和組氨酸等含量較高；成熟時的葡萄主要分布在第一主成分的正方向和第二主成分的負方向，葡萄中蘇氨酸和亮氨酸的含量達到最大值。

圖1 不同生長發育期與果實品質相關物質的主成分分析結果Fig.1 Principal components analysis results of substances related to grape quality at different growth and developmental stages

圖2 長相思葡萄生長發育過程中營養成分的第1、2主成分得分散點圖Fig.2 Scatter plot of nutritional components during the growth and development process of Sauvignon Blanc based on the first and second principal component scores

3 討論

葡萄果實的糖主要儲存在果肉中，是影響葡萄品質的重要因素，隨著果實的成熟大量積累，葡萄光合作用合成的蔗糖從葉片經韌皮部運輸到葡萄漿果，轉化為含量相當的果糖和葡萄糖，蔗糖含量則較低[21]。葡萄果實中糖分合成與積累主要受蔗糖合成酶、轉化酶和蔗糖磷酸合成酶等相關酶的調控[22]。本試驗結果表明，隨著長相思葡萄果實的成熟，可溶性固形物含量成上升趨勢，這與前人研究結果一致[26-27]。釀酒葡萄中的可滴定酸不僅影響葡萄的成熟度和最終品質，葡萄中的pH值也在一定程度上影響葡萄酒的微生物穩定性，不同葡萄品種中的可滴定酸含量各異[28]。實驗結果發現，長相思葡萄中的可滴定酸含量逐漸下降，與成冰等[28-29]的研究結果一致。相關研究表明酸含量在葡萄漿果成熟過程中下降可能是由于漿果中酸的合成受到抑制，也有可能是呼吸作用的消耗轉化成其他物質，葡萄中的有機酸也可以與鉀鹽作用[30]；張雪等[31]認為是由于葡萄漿果體積的增加從而產生的稀釋作用。釀酒葡萄果實中總酚和單寧主要存在于果皮和種子中，對葡萄的抗氧化性起著非常大的作用，酚類物質的合成與積累受外界環境因素和栽培管理措施等影響[32]。本試驗結果表明總酚在發育早期含量較高，隨著葡萄生長發育含量逐漸下降，成熟時含量趨于平穩，單寧含量成熟時比較低，與李楊昕等[33]在玫瑰香葡萄上實驗結果一致。

氨基酸是葡萄中重要的含氮化合物，主要分布在果皮和果肉中，在釀酒過程中為釀酒酵母提供動力，也是葡萄中某些香氣的前體物質，氨基酸濃度和組成會受葡萄品種、成熟度、砧木和氣候等條件影響[22，34]。不同產區、不同品種和不同栽培模式下葡萄果實的氨基酸的積累規律不同。本實驗結果表明絕大大部分的氨基酸組分的含量都隨著葡萄的生長發育而增加，這與BELL S J等[34]研究結果一致。精氨酸是葡萄氨基酸中含量最高的，其次是脯氨酸和亮氨酸。前人研究表明[34]精氨酸在赤霞珠葡萄果實轉色期時大量積累，在成熟前有小幅度的降低，和本實驗研究結果一致。長相思于花后60 d開始變軟，精氨酸含量從187.43 mg/L快速合成至469.52 mg/L，之后含量一直上升，于花后90 d達到最大值（981.19 mg/L），成熟時則小幅度下降為870.09 mg/L。精氨酸是氮的主要儲存形式，接近成熟期的漿果精氨酸濃度的降低可能是向貯藏器官遷移為下一年的營養做準備，精氨酸也會向脯氨酸轉化，脯氨酸也在成熟前達到最大值，成熟時含量略有下降，與前人在赤霞珠葡萄中研究結果類似[34]。亮氨酸是葡萄果實甲氧基吡嗪等的前體物，也是酵母代謝產生高級醇和酸的重要前體物。亮氨酸在長相思葡萄發育過程中一直呈上升趨勢，花后50 d開始快速積累，成熟時達到最大值（336.75 mg/L），表明成熟的葡萄可以提供含量較多香氣前體物質，該類氨基酸的積累規律也與葡萄中相關的香氣積累一致[14]。

4 結論

本試驗對長相思葡萄生長發育過程中葡萄漿果生長發育7個時期葡萄的基本理化指標氨基酸組分進行測定，并對果實品質進行主成分分析。結果表明，可溶性固形物含量和百粒質量、pH值隨著長相思葡萄果實的發育呈上升趨勢；可滴定酸、總酚和單寧含量呈下降趨勢。從葡萄漿果共檢測出16種氨基酸組分，其中胱氨酸從花后40 d到花后90 d呈緩慢下降趨勢，在成熟時（花后105 d）增長至130.52 mg/L；甲硫氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、異亮氨酸和賴氨酸含量在發育過程中保持相對穩定，亮氨酸則從花后40 d的67.77 mg/L持續增長至成熟時的336.75 mg/L，其他9種氨基酸的含量從花后40 d到花后90 d呈增長趨勢，在成熟前略有下降。精氨酸與脯氨酸含量的比值從花后50 d快速增加，成熟時達到最大值（5.67）。表明長相思葡萄在不同發育時期的氨基酸含量差異較大。本試驗分析氨基酸組分形成的關鍵時期，為后期葡萄品質調控提供理論依據。