微生物發酵稻草秸稈生產蛋白飼料培養條件優化

魯旭鋒，朱慧霞 *，吳 歡，姚日生，2，王 淮，2，馬曉靜，張慧敏

（1.合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥 230601；2.合肥工業大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230601）

我國農作物秸稈數量大、種類多，分布廣[1]，但秸稈商品化和產業化程度都較低[2]，目前已被利用的也是粗放的低水平利用[3-4]。在秸稈被轉化利用的過程中，如何破除抗降解屏障以及實現纖維素、半纖維素等組分的增值開發一直是亟待攻克的難題[5-6]。合肥工業大學姚日生課題組利用具有自主知識產權的三氧化硫微熱爆（SO3micro-thermal explosion，STEX）技術[7]對稻草秸稈進行預處理，可以很好地剝離木質素，使得稻草秸稈成為可供微生物發酵過程利用的碳源。劉新歌[8]以經SO3微熱爆技術聯合稀堿預處理后的稻草秸稈水解液作為替代葡萄糖的碳源，可用于槐糖脂的合成中，降低了發酵成本；陳家麗等[9]證明了秸稈經SO3微熱爆技術聯合稀堿預處理后得到的綜纖維素，替代淀粉作為碳源發酵生產頭孢菌素C是完全可行的。

不斷發展的畜牧業對蛋白飼料的需求日益增加[10]。蛋白飼料是指粗纖維含量小于18%，粗蛋白含量達到20%的一種飼料，包括植物性蛋白質飼料、動物性蛋白質飼料、單細胞蛋白質飼料和非蛋白氮飼料[11]。相比其他飼料，單細胞蛋白質飼料具有生長周期短、蛋白含量高和粗纖維含量低等優點，本研究的“蛋白飼料”是指單細胞蛋白質飼料。陳鑫等[12]選用紅芪藥渣為發酵原料，利用白腐菌和產朊假絲酵母進行固態發酵，發酵產物中真蛋白含量為19.05%，粗纖維含量為19.94%；程方等[13]利用馬鈴薯渣為原料，采用黑曲霉和啤酒酵母進行混合發酵，發酵產物中粗纖維含量為8.47%，粗蛋白含量為41.72%。雖然已有許多研究表明微生物利用農業廢料生產蛋白飼料是可行的，但若直接用未經處理的原秸稈進行發酵生產蛋白飼料，發酵后的殘留物中粗纖維含量較高，不符合蛋白飼料的要求，因此目前利用秸稈生產蛋白飼料的研究少，尚未有成熟方案[14-16]。

本研究以SO3微熱爆技術聯合稀堿預處理后的稻草秸稈為原料，通過實驗室保藏的纖維素酶產生菌（籃狀菌（Talaromyces radicus）HFY和綠色木霉（Trichoderma viride）ZY-1）[17-18]與蛋白產生菌（擬威克酵母（Wickerhamiella domercqiae）MZ-3和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZL-1）[19]的不同組合生產蛋白飼料，提出了一種將稻草秸稈利用與蛋白飼料生產相結合的方法，通過此法不僅可將稻草秸稈轉變為產蛋白微生物可利用的碳源，實現了對稻草秸稈的增值化利用，還可用于蛋白飼料的生產中，具有良好的應用前景與市場價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與材料

籃狀菌（T.radicus）HFY、綠色木霉（T.viride）ZY-1、擬威克酵母（W.domercqiae）MZ-3和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）ZL-1：均為本實驗室保藏菌種；稻草秸稈：安徽省合肥市。

1.1.2 培養基

種子培養基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉2%，瓊脂2%（液體培養基中不加），pH自然，121 ℃滅菌20 min；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛（煮沸20～30 min），用紗布過濾，濾液中加入20 g瓊脂，繼續加熱并攪拌，使瓊脂完全溶解，加入葡萄糖20 g，攪拌均勻，稍冷卻后再補足純水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min；

發酵培養基：稻草秸稈（經SO3微熱爆技術聯合稀堿預處理）4%，KH2PO40.3%，MgSO40.05%，酵母粉0.5%，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C115C超凈工作臺、ZWY-2102恒溫培養振蕩器：上海智成分析儀器制造有限公司；YXQ-LS立式蒸汽滅菌器：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；AUY120分析天平：日本Shimadzu公司；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院研究所；Master-Q15純水機：上海和泰儀器有限公司；K1302凱氏定氮儀：上海晟聲自動化分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 稻草秸稈的預處理

采用本課題組具有自主知識產權的SO3微熱爆技術聯合稀堿[20]對稻草秸稈進行預處理。對照組中使用未處理的原稻草秸稈。

1.3.2 菌種活化

綠色木霉（T.viride）ZY-1、籃狀菌（T.radicus）HFY：取低溫保存的菌液分別涂布于PDA培養基和種子培養基中，在30 ℃靜置培養2～3 d后，將孢子接入生理鹽水中，均配制成108個/mL的孢子懸液。

擬威克酵母（W.domercqiae）MZ-3、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）ZL-1：分別接入2%（V/V）菌液至液體種子培養基中，在30 ℃、180 r/min振蕩培養12～24 h。

1.3.3 單菌發酵

發酵培養基中按6%（V/V）接種量接入活化后的菌液，在30 ℃、180 r/min振蕩培養6 d，將發酵產物烘干、粉碎。對照組中使用未處理的原稻草秸稈，同法發酵。以粗纖維降解率及粗蛋白含量為評價指標，考察不同菌株單獨發酵的效果。

1.3.4 微生物組合發酵

取編號為1～4的錐形瓶，分別裝50 mL/250 mL發酵培養基，按表1接入不同組合微生物，總接種量為6%，在30 ℃、180 r/min振蕩培養6 d。

表1 不同比例的微生物組合Table 1 Microbial combinations of different proportions

以發酵產物中粗蛋白含量、粗纖維含量、粗纖維降解率作為評價指標，確定最佳菌株組合，用于后續發酵條件優化單因素和正交試驗。

1.3.5 發酵條件優化單因素和正交試驗

以發酵產物中粗蛋白含量作為評價指標，分別考察發酵時間（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）、總接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、籃狀菌HFY與擬威克酵母MZ-3比例（1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1，V/V）及發酵溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）對發酵效果的影響。

在單因素試驗的基礎上，以粗蛋白含量為評價指標，選擇發酵時間（A）、發酵溫度（B）、籃狀菌HFY與擬威克酵母MZ-3比例（C）為影響因素，利用L9（33）進行正交試驗確定每個因素的最佳水平。正交試驗的因素及水平見表2。

表2 發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6 分析檢測

粗蛋白含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法[21]；纖維素、半纖維素、木質素含量測定：參照文獻[22]；粗纖維含量測定：參照酸堿洗滌法[23]，其計算公式如下：

1.3.7 數據處理

采用Origin 7.5、GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析，采用正交設計助手軟件對正交試驗的因素與水平進行分析。本研究中每個試驗條件下做3個平行樣，結果為3個平行樣的平均值。

2 結果與分析

2.1 預處理前后稻草秸稈主要組分測定

稻草秸稈經過SO3微熱爆技術聯合稀堿處理后，各組分測定結果見表3。由表3可知，經預處理后，稻草秸稈中的木質素含量由12.02%下降至6.20%，比原來降低了48.42%，表明預處理確實能剝離部分木質素。由于木質素的剝離，稻草秸稈中的纖維素所占比重會相應提高，其含量由30.93%上升至49.86%；而半纖維素由于其結構介于纖維素和木質素之間，在預處理過程中會因木質素的剝離而有損失，其含量由39.76%降低至32.94%。纖維素、半纖維素是稻草秸稈中可被利用的主要成分，木質素是阻礙其被利用的第一道壁壘，有效剝離木質素可使纖維素、半纖維素更大程度的暴露出來，使得稻草秸稈更易被利用，這在后續的稻草秸稈發酵生產蛋白飼料的試驗中也得到了驗證。

表3 預處理前后稻草秸稈組分含量Table 3 Contents of straw stalks component before and after pretreatment

2.2 單菌發酵試驗

籃狀菌HFY和綠色木霉ZY-1均可在生長過程中產生纖維素酶，而纖維素酶可分解稻草秸稈中的部分纖維素，故無論是對原秸稈還是預處理后的秸稈，這2株微生物對其中的粗纖維都會有一定程度的降解。由圖1a可知，籃狀菌HFY和綠色木霉ZY-1的粗纖維降解率都達到了30%以上，經過預處理后的秸稈相比于原秸稈，因為SO3微熱爆技術聯合稀堿預處理可以很好地剝離稻草秸稈最外層的木質素，這2株微生物可以更直接地作用于粗纖維，因此它們的粗纖維降解率會相應提高（籃狀菌HFY的粗纖維降解率提高了72.58%，綠色木霉ZY-1提高了66.65%）。而且作為發酵原料，預處理后的秸稈由于木質素的剝離，比原秸稈更合適。

圖1 單菌發酵預處理前后稻草秸稈發酵效果Fig.1 Fermentation effect of straw stalks before and after pretreatment by single strain fermentation

空白組（不接種試驗菌，僅含稻草秸稈和發酵培養基）、枯草芽孢桿菌ZL-1和擬威克酵母MZ-3利用預處理前后稻草秸稈進行發酵，產物中粗蛋白含量的變化結果見圖1b。由圖1b可知，原秸稈的粗蛋白含量為3.11%，經試驗菌枯草芽孢桿菌ZL-1（擬威克酵母MZ-3）發酵后，產物中的粗蛋白含量為6.04%（6.67%），相比空白組提高了94.21%（114.47%）；原秸稈經SO3微熱爆技術聯合稀堿預處理后，粗蛋白含量（3.28%）未發生顯著變化（P＞0.05），經試驗菌枯草芽孢桿菌ZL-1（擬威克酵母MZ-3）發酵后，產物中的粗蛋白含量為6.55%（7.65%），相比空白組提高了99.70%（133.23%）。作為蛋白產生菌，這兩株微生物在各自生長過程中本身就含有較高的蛋白質含量。

結果表明，試驗所用微生物以預處理后的稻草秸稈進行發酵，所得產物的粗蛋白含量和粗纖維降解率均比以原秸稈發酵的更高。因此，選用預處理后的稻草秸稈作為后續發酵生產蛋白飼料試驗的原料。

2.3 不同微生物組合發酵

文獻報道，在構建酶解天然纖維素的連續反應體系方面，多是應用多種微生物混合發酵體系來解除底物和降解產物對酶合成的影響[24-25]。本試驗中，為了得到好的發酵結果，故利用不同的微生物組合發酵稻草秸稈，由發酵產物中的粗纖維含量和粗蛋白含量篩選出最佳的微生物組合，結果見表4。由表4可知，對比1號和3號組合、2號和4號組合，可知籃狀菌HFY對稻草秸稈的降解能力優于綠色木霉ZY-1。3號組合中，發酵產物的粗纖維含量（16.28%）顯著低于1號組合（22.11%），并且粗纖維降解率達到70.83%。對比1號和2號組合、3號和4號組合，可知擬威克酵母MZ-3的產蛋白能力明顯優于枯草芽孢桿菌ZL-1，這與單菌發酵得出的結論一致。1號組合中，發酵產物的粗蛋白含量（13.38%）明顯高于2號組合（9.04%）。3號和4號組合中，該差異變得更加顯著，3號組合的粗蛋白含量（23.50%）遠高于4號組合（13.02%）。在所有組合中，3號組合（籃狀菌HFY∶擬威克酵母MZ-3=1∶1）發酵結束后，產物中粗纖維含量最低（16.28%），粗纖維降解率最高（70.83%），粗蛋白含量也最高（23.50%），符合蛋白飼料的要求。因此，選用籃狀菌HFY∶擬威克酵母MZ-3=1∶1的微生物組合作為最佳菌株組合。

表4 不同菌株組合發酵預處理后稻草秸稈發酵效果Table 4 Fermentation effect of straw stalks after pretreatment by different strain combinations

2.4 發酵條件優化單因素和正交試驗

2.4.1 不同發酵時間對粗蛋白含量的影響

發酵時間對微生物的生長有影響。適合的發酵時間可以有效提高發酵產物的粗蛋白含量，因此確定微生物的發酵時間很有必要[26-27]。

圖2 不同發酵時間對粗蛋白含量的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on crude protein contents

由圖2可知，發酵產物中粗蛋白含量隨著發酵時間在2～8 d范圍的延長而不斷增加，并在發酵第8天時粗蛋白含量達到了最高，為27.50%，此后，隨著發酵時間的繼續延長，粗蛋白含量出現了下降的趨勢。這可能是因為當發酵時間過短時，微生物不能充分利用碳源進行生長，從而粗蛋白含量較低；而發酵時間過長，可能由于微生物自身分解代謝導致粗蛋白含量降低。因此，選擇最適發酵時間為8 d。

2.4.2 不同接種量對粗蛋白含量的影響

圖3 不同接種量對粗蛋白含量的影響Fig.3 Effect of different inoculum on crude protein contents

由圖3可知，隨著接種量在2%～10%（籃狀菌HFY∶擬威克酵母MZ-3=1∶1）范圍內的提高，發酵產物的粗蛋白含量呈現先增加后下降的趨勢。當接種量＜8%時，粗蛋白含量隨接種量增加而提高，并在接種量為8%時，粗蛋白含量達到最大，為23.68%；當接種量＞8%之后，粗蛋白含量有所下降，是因為此時接入的菌體數量較多，營養相對缺乏，兩株微生物都無法很好生長，導致粗蛋白含量略有下降（22.53%）。因此，選擇最佳接種量為8%。

2.4.3 不同菌株比例對粗蛋白含量的影響

不同菌株比例（籃狀菌HFY∶擬威克酵母MZ-3）對應的發酵產物的粗蛋白含量見圖4。

圖4 菌株HFY與MZ-3比例對粗蛋白含量的影響Fig.4 Effect of strain HFY and MZ-3 ratio on crude protein contents

由圖4可知，當籃狀菌HFY∶擬威克酵母MZ-3=1∶1時，粗蛋白含量達到最高值23.71%。當提高體系中籃狀菌HFY的比例時，粗蛋白含量下降，籃狀菌HFY生長過程中產生的纖維素酶會降解稻草秸稈中的纖維素，產生了可供微生物生長的碳源，但此時由于產蛋白的酵母比例小、量少，從而造成粗蛋白含量較低；同樣，當提高擬威克酵母MZ-3的比例時，粗蛋白含量也下降了，是因為體系中由于籃狀菌HFY比例小、量少，產生的纖維素酶量也少，不能較多的降解稻草秸稈中的纖維素，故酵母生長由于缺少碳源受到影響，亦會造成粗蛋白含量較低。因此，選擇籃狀菌HFY∶擬威克酵母MZ-3為1∶1。

2.4.4 不同發酵溫度對粗蛋白含量的影響

發酵溫度對微生物發酵而言，也是一個非常重要的因素，有文獻報道擬威克酵母最適生長溫度為30 ℃[8]。由圖5可知，發酵產物的粗蛋白含量隨發酵溫度在20～40 ℃范圍內呈現先上升后下降的趨勢。當發酵溫度＜30 ℃時，粗蛋白含量隨溫度提高而增加，并在發酵溫度為30 ℃時，粗蛋白含量達到最高，為23.53%；當發酵溫度＞30 ℃后，粗蛋白含量隨溫度提高而下降，是由于發酵溫度過高或者過低，偏離了擬威克酵母MZ-3的最適生長溫度，其生長不良導致產蛋白能力下降。因此，選擇最佳發酵溫度為30 ℃。

圖5 不同發酵溫度對粗蛋白含量的影響Fig.5 Effect of different fermentation temperature on crude protein contents

2.5 發酵條件優化正交試驗

由于接種量對結果影響較小，在單因素試驗的基礎上，以發酵產物的粗蛋白含量作為評價指標，對發酵溫度（A）、發酵時間（B）、籃狀菌HFY與擬威克酵母MZ-3比例（C）進行3因素3水平正交優化試驗，結果見表5。由表5可知，這3個因素對發酵產物粗蛋白含量的影響程度依次為A（發酵時間）＞B（發酵溫度）＞C（籃狀菌HFY與擬威克酵母MZ-3比例），即發酵時間對稻草秸稈發酵生產蛋白飼料影響最大，因為發酵時間的長短直接影響微生物的生長和發酵環境，因此在后續生產放大時應當嚴格控制發酵時間。最佳工藝組合為A2B2C1，即發酵溫度30 ℃，發酵時間8 d，籃狀菌HFY∶擬威克酵母MZ-3=1∶1。在此發酵條件下進行驗證試驗，粗蛋白含量為30.46%，比優化前提高了29.62%，粗纖維含量為14.15%，比優化前降低了13.08%。

表5 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

3 結論

本研究通過組合兩種纖維素酶產生菌和兩種蛋白產生菌對SO3微熱爆技術聯合稀堿預處理后的稻草秸稈和原秸稈進行降解并發酵，結果顯示稻草秸稈經SO3微熱爆技術聯合稀堿預處理后可有效剝離木質素，采用混菌發酵更有利于菌種生長和蛋白飼料的發酵生產。經過單因素和正交優化試驗得到最佳發酵條件為：發酵時間8 d，籃狀菌HFY∶擬威克酵母MZ-3=1∶1，接種量8%，發酵溫度30 ℃。在此優化條件下，粗蛋白含量為30.46%，比原秸稈中粗蛋白含量（3.11%）提高了8.79倍，比優化前（23.50%）提高了29.62%；粗纖維含量為14.15%，比原秸稈中粗纖維含量（49.67%）降低了71.51%，比優化前（16.28%）降低了13.08%，符合蛋白飼料的標準。本研究提出了一種“變廢為寶”的方法，即利用微生物的組合發酵將稻草秸稈轉變為蛋白飼料，這對促進稻草秸稈的增值利用、蛋白飼料的生產和應用具有很好的現實意義，應用前景廣闊。