試管類型及標本儲存方式對血液甲狀旁腺激素的影響

黃回濱

甲狀旁腺激素（parathormone，PTH）由甲狀旁腺主細胞首先合成PTH前體（前甲狀旁腺素原），前甲狀旁腺素原在細胞內被酶裂解，全段甲狀旁腺激素（intact parathormone，iPTH）在細胞內分泌、儲存或裂解[1]。PTH可精細調節骨的合成、分解代謝，對成骨細胞和破骨細胞的分化、成熟、凋亡發揮重要作用，具有升高血鈣[2]，降低血磷的生理功能，是調節細胞外鈣離子濃度的主要激素[3]。甲狀旁腺激素作為礦物質代謝異常的評估指標[4-6]、判斷腎功能損傷程度[7]、甲狀旁腺功能亢進手術治療效果的評價指標等[8-10]，甲狀腺癌切除術后甲狀旁腺功能監測[11]，甚至與認知功能有關等[12]，其臨床應用研究更加廣泛，診斷價值也日趨受到重視，而影響血清iPTH檢測結果準確性和可靠性的因素較多，除了檢測方法、儀器性能等因素外，標本的采集及處理方式是需要關注的重點，采血管中添加的成份是否對檢測項目存在潛在的干擾，不合適的標本儲存形式是否導致甲狀旁腺激素的降解等問題，是降低患者風險、提高檢驗質量不容忽視的問題。因此本文按照實驗室正常工作流程，就試管類型及標本儲存方式對血液全段甲狀旁腺激素檢測結果的影響進行了研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本來源 考慮標本濃度范圍能覆蓋低、中、高、較高濃度值，故選取2019年1月5日—2月28日于醫院就診的門診及住院慢性腎功能衰竭患者15例，普外科甲狀旁腺術前患者5 例，隨機選取的門診患者及體檢者各5例。其中男性15例，女性15例，年齡23～75歲。

1.1.2 設備來源 全段甲狀旁腺激素檢測儀器為SIEMENS ADVIIA Centaur XP immunoassay System檢測儀，使用的試劑為該儀器配套試劑盒及標準品，質控品為BIO-RAD公司的Lyphochek Immunoassay Plus Control；離心機：安徽中科中佳科學儀器公司生產的KDC-1044L大容量低速離心機；試管：日本積水創格生產的INSEPACK真空采血管，包括分離膠、促凝劑、EDTA-K3 、無添加劑的真空采血管。

1.2 研究方法

清晨空腹采集以上患者及體檢者的靜脈血，分別按順序采集于無添加劑管、促凝劑管、分離膠管、肝素鋰抗凝劑、EDTA-K3抗凝真空采血試管中，除無添加劑管外，將其他各管輕輕顛倒充分混勻，同時靜置30 min ，3 500 r/min，離心力2 352xg，離心10 min，查看血清血漿分離情況，分離完全，無纖維絲掛壁現象，所有標本無溶血、黃疸及脂血現象。立即上機檢測，后在室溫放置4 h、8 h，2～8℃冷藏24 h、48 h、72 h再分別檢測，分析其結果。

1.3 觀察指標

全段甲狀旁腺素。

1.4 統計學方法

應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料采用差值配對t檢驗、P＜0.05代表差異有統計學意義，采用Bland-Altman分析和雙側置信區間的一致性檢測（LOA 95%上、下限范圍檢測）。根據衛生部臨床檢驗中心臨床實驗室室間質量評價標準，iPTH項目可接受范圍為25%，LQA上、下限95%可信區間在25%范圍內為可接受范圍，超出即為不可接受。

2 結果

2.1 不同采血管即刻檢測結果

表1結果顯示以EDTA-K3抗凝管即刻檢測結果為對照管，促凝劑管、肝素管、分離膠管、無添加劑管的即刻檢測結果差異無統計學意義（P＞0.05），雙側置信區間的一致性檢測，在25%誤差允許范圍內，而分離膠管的P值為0.026，P＜0.05，雙側置信區間的一致性檢測，LOA下限的95%置信區間為-20.1（-28.0，-12.2），超過25%誤差允許范圍。

2.2 不同儲存條件下iPTH檢測結果

2.2.1 EDTA-K3抗凝管iPTH結果 EDTA-K3抗凝管在室溫放置4 h、室溫放置8 h差異無統計學意義。見表2。

2.2.2 肝素鋰抗凝管iPTH結果 肝素鋰抗凝管在室溫放置4 h檢測結果差異無統計學意義，而在室溫放置8 h、2～8℃ 24 h、48 h、72 h的檢測結果差異無統計學意義。見表3。

2.2.3 分離膠采血管、促凝劑采血管、無添加劑管iPTH結果與即刻檢測比較，分離膠采血管、促凝劑采血管、無添加劑試管在室溫放置4 h、8 h、2～8℃ 24 h、48 h、72h的檢測結果差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4～6。

3 討論

本實驗檢測iPTH所使用的SIEMENS ADVIA Centaur XP儀器及配套的檢測試劑系統，對于樣本的要求是推薦使用血清或EDTA血漿；而WHO對于iPTH檢測項目樣本采血管的要求是EDTA為最佳抗凝劑，血清為可用標本[13]。因此本研究實驗以EDTA-K3抗凝管樣本為對照，比較不同采血管iPTH即刻檢測結果、各種采血管在不同貯存條件下的檢測結果差異。結果顯示促凝劑管、肝素鋰抗凝管、無添加劑管的iPTH即刻檢測結果與EDTA-K3抗凝管的檢測結果比較，在允許的誤差范圍內；而分離膠采血管則超過了25%的允許誤差。

分離膠是一種具疏水性質的有機化合物，其比重介于血清與血細胞之間。血液經分離膠促凝作用并經一定的離心力離心后，分離膠可在血清與血細胞之間形成隔離層，有效的隔離血清與血細胞間的物質交換，保證血清成分的穩定性，因此備受青睞，廣泛應用于各種生化免疫檢驗。然而，本研究顯示，分離膠采血管并不適合血液iPTH檢測，原因可能為分離膠在一定條件下可分解，并溶解在血清中，形成“油滴”浮于血清表面[14]，本實驗的檢測數據觀察發現分離膠采血管的iPTH總體均值為（276.9±112.3）；與EDTA-K3的結果（283.6±113.2）比較，差異不大，但是差值的配對t檢驗結果P值為0.026，P＜0.05，說明個體數據間差異顯著，推測分離膠管中可能存在某種物質，促進iPTH的降解或由于“油滴”的影響，當環境溫度超過分離膠管保存的溫度時，分離膠易溶解在血清中。另外，患者由于高蛋白血癥、高鈉等導致血清密度升高的因素都會影響血清的分離效果，使分離膠微小分子漂浮于血標本中，而導致檢測結果更不穩定。

表1 不同采血管iPTH即刻均值及相關統計結果

表2 EDTA-K3抗凝管不同儲存條件下iPTH均值及相關統計結果

表3 肝素鋰抗凝管不同儲存條件iPTH均值及相關統計結果

表4 分離膠管不同儲存條件下iPTH均值及相關統計結果

表5 促凝劑采血管不同儲存條件下均值及相關統計結果

表6 無添加劑試管不同儲存條件下均值及相關統計結果

美國國家臨床實驗室標準化委員會（CLSI）及本實驗檢測系統關于iPTH檢測血液樣本處理和保存的建議：EDTA血漿樣本穩定性室溫8 h，4℃可穩定72 h，血清樣本室溫穩定4 h，4℃穩定48 h。本實驗結果顯示EDTA-K3在室溫4 h、8 h檢測結果均在可接受誤差范圍內，2～8℃ 24 h、48 h、72 h檢測結果均超過允許范圍;肝素鋰抗凝管在室溫4 h的檢測結果在允許誤差范圍內，而室溫8h、2～8℃ 24 h、48 h、72 h檢測結果均超過允許范圍;促凝劑管、無添加劑管在室溫4 h、8 h、2～8℃ 24 h、48 h、72 h檢測結果均超過允許范圍。首先造成結果差異的原因是本實驗根據WHO對于iPTH檢測項目樣本采血管的要求，以EDTA為最佳抗凝劑，因此認為應以EDTA-K3即刻檢測結果為標準，進行比較，而試劑說明書是以自身抗凝管為對照作為穩定性判斷標準。肝素具有增強抗凝血酶活性的特質，血液標本經肝素抗凝作用后，抗凝血酶III活性增強，血小板聚集被抑制，具有抗凝效果好、離心速度快等優點[15]；促凝劑管中添加了含硅石粉、碳素粉等具有非生理性促凝效果的成分，縮短了血液凝固時間，使血清能夠快速分離，但其添加劑屬于生物制劑，具有生物降解性質，在一定條件下可能產生降解，其降解的產物可能與待檢物質產生化學反應[16]；無添加劑管血液凝固時間長，血清不能快速分離，推測血液可能在凝固過程中加速了iPTH的分解；有學者的研究顯示用肝素鋰抗凝管檢測，需放于2～8℃保存[17]，也有研究表明，添加促凝劑的采血管可以使PTH快速降解[18]；用無任何添加劑的采血管采集標本后，放置時間越久，PTH降解越快。本研究結果顯示使用這兩種采血管與EDTA-K3比較，存在明顯差異，推測促凝劑及肝素鋰試管中存在的其他物質影響血清里某些酶的活性，從而影響了iPTH的降解過程。但各種采血管在2～8℃ 24 h后降解速度均減緩，推測可能與血液中導致iPTH降解的酶已失活或者細胞死亡有關，低溫環境更有利于iPTH的保存。

綜上所述，本實驗檢測過程按照實驗室正常工作流程進行檢測，更接近于實驗室真實的標本穩定性能。檢測系統說明書中樣本的處理和儲存信息僅供用戶參考，實驗室用戶可在行標基礎上建立真實可靠，更合適的標本采集及穩定性標準。由于標本需要量大，本研究中無法對冷凍條件下iPTH的變化再進行檢測分析，各種采血管條件下iPTH在-20℃、-70℃儲存條件下是否更加穩定需要進一步的研究。