2型糖尿病患者與健康人之間腸道菌群的對比分析

周強 徐靜 蔡舒婷 熊紅萍 俞冰鴻

近年來，青少年2型糖尿病的發病率呈現出逐年上升的趨勢，這主要是由于人們生活水平有所提升，飲食結構不合理，除此之外，糖尿病的檢測水平也是一項影響因素[1]。糖尿病成為新世紀以來的一項主要公共衛生問題，在這一情況下，世界范圍內對糖尿病的病因、檢測方式以及治療方式進行研究，其中最關鍵的內容為微生物與糖尿病之間存在的聯系[2]。有研究證明[3-4]，糖尿病與患者腸道菌群的種類以及數量有關。糖尿病患者腸道益生菌數量與自身血糖水平呈負相關。因此，需對糖尿病患者的腸道菌群進行研究，為早期檢測，早期治療提供依據。本研究對健康體檢者以及2型糖尿病患者的腸道菌群進行對比，探討其差異，明確糖尿病與腸道菌群之間的聯系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取本院收治的20例青少年2型糖尿病患者作為觀察組，另選取20例同期健康體檢人員作為健康組，所有患者選取時間均為2019年3月—2020年3月，患者同意參與研究，簽署研究同意書；醫院醫學倫理會審批通過本次研究。健康組中，男女比例為12：8，年齡15～39歲，平均（24.51±2.14）歲；觀察組中，男女比例為14：6；年齡14～40歲，平均（25.34±1.12）歲；所有研究對象在1個月內均未接受抗生素進行治療，不存在腹瀉等胃腸道疾病，不存在明顯腎臟功能缺陷以及肝臟功能缺陷，且不存在血液系統疾病以及其他內分泌系統疾病。所有參與研究人員的糞便標本均于清晨采集，且均于采集之后2小時之內放置于-80℃的超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

（1）糞便菌群DNA提取。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取DNA，嚴格按照說明書操作，最后加入80μL的Buffer TE洗脫得到所需基因組DNA。

（2）PCR擴 增。PCR擴 增 體 系 為10×PCR buffer 5μL，5×Q solutuion 10μL；正向反向引物均為0.3μL，基因組DNA為5μL，d NTPs為0.2 mM，Mg Cl2為2 mM，Taq DNA聚合酶為2 U，添加無菌水，增加至50μL。PCR擴增條件：3 min 90℃，40個循環，3分鐘72℃，正向引物、反向引物分別為：5-GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、5-TTACTCACCCGTCCGCCACT-3。采用生物素標記正向引物p BR5.SE 5端。

（3）16S r DNA文庫建立。PCR產物采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳之后，割膠回收純化目的片段，將其與p MD19T載體連接，轉化感受態細胞，將其放置于培養基上，在37℃下進行16小時的培養，最后經藍白斑進行篩選，挑出疑似陽性進行克隆，隨手實施菌液PCR鑒定。鑒定結果為陽性的克隆子組建16S r DNA文庫，在其中隨機挑選30個進行測序。將最終測序結果與基因數據庫進行比對。

表1 糞便菌群對比 [個（%）]

表1 （續）

表2 擬桿菌屬及雙歧桿菌屬定量PCR對比（log N/g， ±s）

表2 擬桿菌屬及雙歧桿菌屬定量PCR對比（log N/g， ±s）

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（4）焦磷酸測序。將47 μL的緩沖液與3 μL鏈親和素包被磁珠添加至50 μL含有生物素標記的擴增產物中，并持續震蕩混勻10 min，確保磁珠能夠與PCR擴增產物充分結合，將焦磷酸測序儀中的配套單鏈分離鈍化系統吸頭置入混合液中，吸干液體之后，分別在濃度為70%的乙醇、變性緩沖液以及洗滌液中分別清洗帶有磁珠的吸頭5 s，釋放磁珠至platelow板中，將platelow板放置于80℃的環境中變性，時間控制為2 min，取出冷卻至室溫狀態。采用SQA模式的測序程序，將得出的測序結果與數據庫序列進行對比，鑒定結果應為其余數據庫序列100%匹配，本次采用的測序引物為p BR-V1.AS。

（5）定量PCR。分別采用相應的引物對擬桿菌和雙歧桿菌屬細菌進行定量PCR。PCR均采用的反應體系為25 μL，采用的反應程序為95 ℃ 1 min，95 ℃ 25 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個循環。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組糞便菌群比較

從兩組研究對象糞便提取細菌各600個，觀察組的擬桿菌屬、普氏菌屬、靈芝菌屬以及雙歧桿菌屬均多于健康組，差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組可培養菌、普雷沃氏菌屬明顯少于健康組，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組厚壁菌門和變形菌門各菌屬對比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 擬桿菌屬及雙歧桿菌屬細菌定量PCR對比

觀察組擬桿菌屬及雙歧桿菌屬的定量PCR水平高于健康組（P＜0.05），見表2。

3 討論

青少年2型糖尿病的主要發病因素為人體胰島β細胞功能缺陷以及胰島素抵抗[5]。如果人體血糖水平過高，胰島β細胞就會通過分泌胰島素的方式達到降糖目的，但如果胰島β細胞功能存在缺陷，無法分泌胰島素，降糖效用無法發揮，導致血糖升高[6-7]。人體自身的能量代謝與自身腸道內存在的微生物菌群之間存在密切聯系，且腸道微生物菌群在人體消化吸收過程中也有一定作用，菌群種類以及數量的變化可能會導致機體發生代謝性疾病[8]。有研究指出[9-10]，人體的免疫系統、內分泌系統以及神經系統與體內各種微生物之間存在密切聯系。腸道菌群大多存在與機體小腸以及結腸部位，在十二指腸、回腸上端以及空腸、胃部存在較少。腸道中的正常菌群能夠在腸黏膜表面形成屏障，調節免疫功能，避免致病菌侵入。糖尿病患者由于代謝失調，其腸道菌群種類以及數量不同于健康人[11-13]。本研究結果顯示，觀察組患者的擬桿菌屬、普氏菌屬、靈芝菌屬以及雙歧桿菌屬均多于健康組，差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組患者的可培養菌、普雷沃氏菌屬明顯少于健康組，差異有統計學意義（P＜0.05）。觀察組患者的雙歧桿菌以及擬桿菌的定量PCR水平高于健康組，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示健康人群與糖尿病患者的不同屬細菌分布存在顯著差異，這樣由于青少年2型糖尿病患者的糖代謝紊亂，使得腸道內耐受性較弱的菌群如可培養菌、普雷沃氏菌屬等明顯減少，隨著患者的免疫力減弱，使得一些致病菌如雙歧桿菌、擬桿菌等增多。因此，可證明青少年2型糖尿病患者腸道菌群處于失調狀態。

綜上所述，青少年2型糖尿病患者腸道菌群失調，這與血糖有一定關系，通過對比腸道菌群的差異能夠為調節腸道菌群改善糖代謝提供依據。