西格列汀對糖尿病大鼠胰島β細胞CXCL10及其受體表達的影響

方彥玲 許麗萍 連超煒 張浩

【摘要】 目的：探究西格列汀對糖尿病大鼠胰島β細胞CXC趨化因子10（chemokine ligand-10，CXCL10）及其受體表達的影響。方法：將90只SD大鼠按照隨機數字表法分為干預組30只（高脂高糖飼料喂養+西格列汀灌胃）、模型組30只（高脂高糖飼料喂養+生理鹽水灌胃）和空白組30只（普通飼料喂養+生理鹽水灌胃）。檢測兩組大鼠給藥前后血糖指標變化，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察胰島細胞組織學改變，并比較兩組大鼠胰島β細胞CXCL10及其受體mRNA和蛋白水平。結果：治療前，干預組及模型組FPG、FINS、HOMAIR均明顯高于空白組，ISI均明顯低于空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）;治療8周后，干預組FPG、FINS、HOMAIR均明顯低于模型組，ISI明顯高于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）。干預組細胞數少于空白組，但多于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）。干預組CXCL10及CXCL3的mRNA、蛋白表達水平均明顯低于模型組，均高于空白組;干預組TLR4的mRNA、蛋白表達水平均顯著高于模型組和空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：西格列汀能夠明顯降低糖尿病大鼠的FPG、FINS水平，并下調糖尿病大鼠胰島β細胞CXCL10及其受體的表達量。

【關鍵詞】 糖尿病 西格列汀 胰島β細胞 CXC趨化因子10 CXC趨化因子3

[Abstract] Objective： To investigate the effect of sitagliptin on the expression of CXC chemokine 10 （CXCL10） and its receptor in pancreatic beta cells of diabetic rats. Method： A total of 90 SD rats were divided into 30 intervention group （high-fat high-sugar diet feeding with siglitine gavage）， 30 model group （high-fat high-sugar diet feeding with normal saline gavage） and 30 blank group （general feed feeding with normal saline gavage）.Hematoxylin-eosin （HE） staining was used to observe the histological changes of islet cells， and the mRNA and protein levels of CXCL10 and its receptor were compared between the two groups. Result： Before treatment， FPG， FINS and HOMAIR in the intervention group and model group were significantly higher than those in the blank group， and ISI were significantly lower than that in the blank group， with statistically significant differences （P<0.05）; 8 weeks after treatment， FPG， FINS and HOMAIR in the intervention group were significantly lower than those in the model group， and ISI was significantly higher than that in the model group， with statistically significant differences （P<0.05）. The number of cells in the intervention group was less than that in the blank group， but more than that in the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The mRNA， protein expression levels of CXCL10 and CXCL3 in the intervention group were significantly lower than those in the model group， and higher than those in the blank group， and the mRNA， protein expression level of TLR4 in the intervention group were significantly higher than those in the model group and the blank group （P<0.05）. Conclusion： Siglitine can significantly reduce the FPG and FINS levels of diabetic rats， and down-regulate the expression of CXCL10 and its receptor in the pancreatic islet of diabetic rats.

[Key words] Diabetes Sitagliptin Islet β cells CXC chemokine ligand-10 CXC chemokine ligand-3

糖尿病是常見的一種代謝疾病，是由環境和遺傳因素共同導致的，該病病程長、病情復雜、并發癥多[1]。二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4 inhibitor，DPP-4）抑制劑是一種新型降糖藥，其能夠抑制胰島素降解，增加餐后胰島素水平[2-3]，其中西格列汀是最常用的一種藥物。有研究顯示，西格列汀通過抑制DPP-4，上調胰高血糖素樣肽-1基因表達，增加胰島細胞增殖分化，進而降低甘油三酯，改善血糖[4]。CXC趨化因子10（chemokine ligand-10，CXCL10）是趨化因子的一個亞族組成部分，其與受體結合，具有趨化炎性反應的作用，與多種疾病發生均相關[5]。文獻[6-7]研究顯示，CXCL10參與胰島β細胞凋亡。目前，有關DPP-4抑制劑西格列汀對糖尿病的治療效果及糖尿病患者血清中CXCL10的表達意義研究較多[8]，有關DPP-4抑制劑對胰島β細胞CXCL10及其受體表達的影響研究較少。本研究旨在探討DPP-4抑制劑西格列汀對CXCL10及其受體表達的影響。

1 對象與方法

1.1 實驗對象 6周齡的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）雄性斯潑累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠90只，體質量180～220 g，購于XX醫學院實驗動物中心，在恒溫（22±2）℃恒濕（55±15）%無菌屏障中進行飼養，12 h明暗循環，所有的大鼠均在正常飼養條件下分籠飼養，可自由獲取食物和水。大鼠經適應性喂養1周，采用隨機數字表法分為干預組、模型組和空白組，各30只。本研究經醫院倫理委員審核并批準。

1.2 實驗試劑 高脂高糖飼料，購自北京博泰宏達生物技術有限公司;普通飼料，購自遼寧長生生物技術股份有限公司;聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）分析儀，山東高密彩虹分析儀器有限公司;PCR試劑盒，上海將來實業股份有限公司;磷酸西格列汀片（生產廠家：杭州默沙東制藥有限公司，批準文號：國藥準字J20140095，規格：50 mg）;胰島素試劑盒，上海科順生物科技有限公司;血糖儀及配套試紙條，德國羅氏公司。

1.3 建立動物模型 干預組和模型組采用高脂高糖飼料，空白組采用普通飼料，均喂養8周。干預組和模型組給予腹腔注射（0.25%，30 mg/kg）鏈脲佐菌素（USP級，STZ，生產廠家：Sigma公司，規格：1 g︰5 g），72 h后測尾靜脈血糖，血糖>16.7 mmol/L即造模成功。干預組給予西格列汀100 mg/kg治療，模型組和空白組給予同體積生理鹽水，1次/d，灌胃[9]，待建模成功后，進行后續實驗。

1.4 血糖指標檢測 治療前和治療8周后，禁食12 h，抽取大鼠尾靜脈血3 mL，放置30 min，以3 000 r/min離心15 min，放置至分層，取上清液，置于冰箱（-20 ℃），保存待測。采用血糖分析儀檢測空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG），采用酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測空腹胰島素（fasting serum insulin，FINS），計算胰島素抵抗指數（homostatic model assessment of insulin resistance，HOMAIR）、胰島素敏感性指數（insulin sensitivity index，ISI）;操作按照試劑盒說明書完成;HOMAIR=FPG×FINS/22.5;ISI=ln[（FPG×FINS）-1]。

1.5 組織病理學蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 SD大鼠麻醉成功后，取出胰腺組織，甲醛固定，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木素染色5 min，沖洗，伊紅染色1 min，乙醇脫水，透明，中性樹脂封片，用顯微鏡觀察。

1.6 逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測CXCL10及其受體mRNA水平 總RNA提取和mRNA逆轉錄為cRNA均按照試劑盒說明書進行。CXCL10 mRNA引物序列：上游：5-CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3，下游：5-GGCTCGCAGGGATGATTTCAA-3。PCR反應條件：90 ℃ 5 min、80 ℃ 20 s、70 ℃ 30 s，45個循環，70 ℃ 30 s收集信號;解離曲線分析：溫度75～90 ℃。由DNA擴增儀計算mRNA表達水平。

1.7 蛋白質印跡法（Western Blot，WB）檢測CXCL10及其受體蛋白水平 將胰腺組織裂解，加熱，冷卻，離心，去除沉淀，分離，進行電泳，溫育，洗滌，發光檢測，分析CXCL10及其受體蛋白表達水平。

1.8 統計學處理 采用SPSS 25.0軟件進行統計學數據處理。符正態分布的計量資料采用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，多組間比較采用方差分析，采用Bonferroni法進行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較 干預組，平均體質量（215.00±12.32）g;模型組，平均體質量（213.00±10.68）g;空白組，平均體質量（214.00±11.74）g。三組平均體質量比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 三組給藥前后大鼠血糖指標比較 治療前，干預組及模型組FPG、FINS、HOMAIR均明顯高于空白組，ISI均明顯低于空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）;治療8周后，干預組FPG、FINS、HOMAIR均明顯低于模型組，ISI均明顯高于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 HE染色光鏡下觀察胰腺組織 HE染色結果顯示，空白組胰腺組織形狀規則，分布較均勻，界限清晰，胰島β細胞形態正常，排列整齊，細胞數目（89.57±8.36）個;模型組胰腺組織形狀不規則，分布較散，結構界限模糊，胰島β細胞胞核皺縮，體積縮小，細胞數目（34.57±20.12）個;干預組胰腺組織形狀明顯改善，體積有所增加，細胞數量（56.25±19.34）個。見圖1。三組細胞數目比較，差異有統計學意義（F=62.144，P<0.05）;此外，干預組細胞數少于空白組，但多于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.4 三組CXCL10及其受體mRNA表達比較 干預組與模型組CXCL10及其受體CXCL3的mRNA表達量均明顯高于空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）;干預TLR4 mRNA表達量均明顯高于模型組和空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.5 三組受體蛋白表達水平比較 CXCL10、CXCL3、TLR4的蛋白表達水平在干預組分別為（1.02±0.16）、（1.06±0.18）、（1.10±0.17），在模型組分別為（2.41±0.25）、（1.97±0.24）、（0.58±0.14），在空白組分別為（0.49±0.08）、（0.65±0.11）、（0.50±0.12）。三組CXCL10、CXCL3、TLR4水平比較差異均有統計學意義（F=8.215、6.376、4.522，P<0.05）;干預組CXCL10和CXCL3的蛋白表達水平均顯著低于模型組，均高于空白組，TLR4蛋白的表達水平顯著高于模型組和空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

3 討論

糖尿病臨床表現主要為多食、多尿、多飲、消瘦等，若不能得到有效的控制，可出現各種并發癥，遍及患者全身重要器官，嚴重影響患者的生活質量[10]。糖尿病患者機體內的高血糖、胰島素抵抗、高血脂等病理狀態引起的炎癥反應可導致糖尿病性心臟病的發生，有效改善胰島素抵抗及控制血糖水平，降低炎癥反應，是預防糖尿病性心臟疾病發病的重要途徑[11]。

胰島β細胞與糖尿病的發生與發展密切相關，其功能減退，是引起糖尿病發病的主要原因，且隨著病程延長，胰島β細胞功能顯著降低[12]。DPP-4抑制劑能夠抑制β細胞凋亡，促進其重生，增加體內總數量，進而控制血糖[13]。相比較傳統降糖藥，DPP-4抑制劑的臨床治療效果更好，且安全性高，耐受性好。西格列汀是較為常用的一種DPP-4抑制劑，能提高腸促胰島素水平，降低胰高血糖素水平，具有葡萄糖依賴性。文獻[14]研究顯示，采用西格列汀治療糖尿病，能顯著降低患者FPG、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c）水平。本研究中，對糖尿病大鼠采用西格列汀干預，結果顯示，干預組大鼠FPG、FINS、HOMAIR均明顯低于模型組，ISI顯著高于模型組（P<0.05），說明西格列汀能夠控制糖尿病大鼠的血糖水平。

Martinov等[15]研究表明，胰島耐受性與胰腺環境有關，當胰腺無炎癥反應的情況下，CXCL10會缺失。炎癥反應是造成胰島β細胞功能異常、凋亡的重要原因，長期暴露于炎癥因子，可引起β細胞基因異常表達，使其功能喪失，最終凋亡[16]。趨化因子具有趨化性，其在免疫細胞募集和遷移中發揮重要。CXCL10是一種趨化因子，可介導炎癥反應，抑制血管生成，在許多疾病發病中具有重要作用[17]。國外有研究用CXCL10對胰島β細胞進行干預，結果顯示，干預后的胰島素mRNA表達水平明顯低于對照組，細胞凋亡明顯增加[18]。胰島β細胞可產生CXCL10，而CXCL10又能影響胰島細胞的胰島素分泌功能，抑制胰島β細胞的增殖，并誘導其凋亡，最終促進糖尿病的發生。有研究顯示，糖尿病患者發病早期時血清CXCL10水平呈現高表達，在抑制其內源性表達后，糖尿病發病率明顯降低，說明CXCL10在糖尿病發病中有著重要作用[19]。在糖尿病大鼠模型中，胰島β細胞分泌CXCL10是吸引其受體CXCR3浸潤胰島的動力。T輔助細胞高度表達CXCR3，并被CXCL10激活，產生免疫反應。CXCL10與CXCR3結合，趨化炎癥因子，至炎癥部位，在淋巴細胞、自然殺傷細胞、T輔助細胞中均有表達。由胰島β細胞產生的CXCL10能夠通過自分泌與其受體結合，進而抑制胰島β細胞再生，當CXCR3缺失時，糖尿病發病率顯著降低。文獻[20]研究顯示，在糖尿病患者中，胰腺中表達CXCR3的細胞數量及CXCL10水平均顯著上調，說明CXCL10及其受體與糖尿病發病密切相關。目前，有關DPP-4抑制劑對胰島β細胞CXCL10及其受體表達影響的相關研究較少，本研究選用DPP-4抑制劑西格列汀作為干預藥物，研究其對CXCL10及其受體表達的影響，結果顯示，干預組胰腺組織形狀不規則，界限模糊，細胞數量較空白組少，較模型組多。經西格列汀灌胃治療后，大鼠胰島β細胞CXCL10及其受體mRNA及蛋白表達量明顯降低。說明DPP-4抑制劑能夠逆轉胰島β細胞減少，下調CXCL10及其受體的表達量。國外一項隨機實驗研究顯示，西格列汀能夠顯著降低CXCL10表達[21]，與本研究結果相符合。

綜上所述，DPP-4抑制劑能夠明顯降低糖尿病大鼠的FPG、FINS水平，并下調糖尿病大鼠胰島β細胞CXCL10及其受體的表達量，可為糖尿病的臨床治療提供新的靶點。

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（收稿日期：2020-05-20） （本文編輯：張爽）