痰熱清注射液聯合藥物對30株耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌體外抑菌作用研究

劉 佳 陶慶春 李公民 趙玉玲 程麗娟

1.北京市房山區中醫醫院檢驗科，北京 102400；2.北京中醫藥大學第三附屬醫院檢驗科，北京 100029；3.北京市燕化醫院檢驗科，北京 102500；4.北京市房山區良鄉醫院檢驗科，北京 102401

鮑曼不動桿菌是醫源性感染的重要病原菌體之一，該菌具有存活期長、耐藥性強等特點，被稱為革蘭陰性桿菌中的“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）”。隨著臨床不規范應用舒巴坦的β 內酰胺類抗菌藥物的復合制劑、氨基糖苷類及碳青霉烯類等藥物治療，造成耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌（acinetobacter baumannii resistant to carbapenem，CRAB）的檢出率越來越高[1]，特別是醫院重癥監護病房（intensive care unit，ICU）感染日益嚴重，已列為多重耐藥監測目標[2]。痰熱清注射液有清熱解毒、抑菌及提高人體免疫等功能，且價格低廉、副作用較少，通常作為廣譜抗菌殺毒藥物大量應用[3-4]。有研究[5]表明中成藥與抗菌藥物聯用能產生顯著的增效作用。有體外抑菌實驗將痰熱清作為耐藥菌的抑制觀察指標，效果較為顯著[6]。因此，本試驗選用痰熱清注射液為抑菌制劑，采用微量肉湯稀釋法測定其分別聯合頭孢他啶、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦及亞胺培南西司他丁鈉對30 株CRAB 體外抑菌作用，觀察藥物聯合應用抑菌最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），部分抑菌濃 度 指 數（fractional inhibitory concentrationindex，FIC）的變化，確定痰熱清注射液與不同抗菌藥物聯用的抑菌效果，探討臨床治療耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌感染的中西醫結合思路。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株 標本來自2019 年1 月—11 月北京市房山區中醫醫院、北京市房山區良鄉醫院、北京市燕化醫院、北京市房山區第一醫院的ICU 病房分離30 株耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌，且排除同一患者重復菌株。全部菌株均采用全自動微生物鑒定和藥敏分析系統進行確定。

1.1.2 實驗藥物 痰熱清注射液（江蘇康緣藥業股份有限公司，生產批號190534，10 ml/支）；頭孢他啶（海南海靈化學制藥有限公司，生產批號1906201，0.5 g/瓶）；頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（輝瑞制藥有限公司，生產批號AX0181，1.5 g/瓶）；哌拉西林鈉他唑巴坦（華潤雙鶴藥液股份有限公司，生產批號Q1807301，2.5 g/瓶）；亞胺培南西司他丁鈉（杭州默沙東制藥有限公司，生產批號R023135，1.0 g/瓶）。

1.1.3 實驗儀器和設備 血平板（河南美凱生物科技有限公司）、M-H 肉湯培養基（英國OXOID 公司）、CIassⅡ BSC 生物安全柜（ESCO 公司）、VITEK2 Compact 全自動微生物鑒定和藥敏分析系統（法國生物梅里埃公司）、電熱恒溫培養箱（上海樹立儀器儀表有限公司）、電子天平（賽多利斯BSA224S-CW）、96 孔板等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液配制 分別取經分純的30 株CRAB 菌落，用5 ml 生理鹽水配制成0.5 麥氏比濁菌液，再用MH 肉湯進行稀釋，保證最終加入實驗96 孔板內的菌液濃度為5×105CFU/ml。

1.2.2 微量肉湯最低抑菌濃度（MIC）測定 用MH肉湯配制頭孢他啶、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦及亞胺培南西司他丁鈉的最高藥液濃度，均為1024 μg/ml。痰熱清最高藥液濃度為1000 μl/ml（1 ∶1）。分別對上述藥物濃度進行一系列的倍比稀釋，頭孢他啶、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦及亞胺培西司他丁鈉濃度為1024、512、256 、128、64、32、16、8 μg/ml。痰熱 清稀 釋 原 液（1 ∶1、1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128）。再將稀釋至不同濃度的藥液180 μl 加入96 孔板中，最后加入已配制菌液20 μl。同時做空白和陽性對照，37 ℃培養24 h后觀察痰熱清及四種藥物對30 株CRAB 的MIC 結果，并記錄。

1.2.3 聯合藥物濃度MIC 測定 根據痰熱清、頭孢他啶、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦及亞胺培南西司他丁鈉的MIC，確定2 倍MIC90 作為最高稀釋濃度，并對聯用的藥物分別倍比稀釋配制8 個不同濃度。采用棋盤稀釋法，每組分別取稀釋濃度的痰熱清和四種藥物各90 μl，再加入30 株菌株的菌液20 μl 至96 孔板。35 ℃培養24 h，最終確定聯合用藥最佳抑菌組合的各自MIC 值，記錄并計算FIC 指數。

1.3 實驗結果判讀

根據藥物單用和聯用的MIC，參照《臨床微生物檢驗標準化操作》第3 版[7]，計算FIC。FIC=甲藥聯合的MIC/甲藥單用的MIC+乙藥聯合的MIC/乙藥單用的MIC。FIC ≤0.5 為協同，0.5 ＜FIC ≤1為相加，1 ＜FIC ≤4 為無關，FIC ＞4 為拮抗。

2 結果

2.1 藥物單用及聯用的MIC

痰熱清分別聯合四種抗菌藥物與各自單獨用藥抑菌作用相比較，MIC 范圍、MIC50 和MIC90 均有明顯降低，見表1。

表1 痰熱清及抗菌藥物藥物單用及聯用MIC值范圍（n＝30）

表3 痰熱清1/8μl/ml聯合藥物菌株分布情況

2.2 痰熱清聯合用藥抑菌菌株的分布

痰熱清1/4μl/ml+頭孢他啶64 μg/ml，抑菌菌株數量為7 株；痰熱清1/8μl/ml+頭孢他啶64 μg/ml，抑菌菌株數量14 株。痰熱清1/16μl/ml+頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉64 μg/ml，抑菌菌株數量13 株，見表2 ～4。

表4 痰熱清1/16μl/ml聯合藥物菌株分布情況

2.3 聯合抑菌FIC指數結果

痰熱清聯合藥物抑菌FIC 指數以相加和協同作用為主。頭孢他啶聯用FIC 指數：FIC ≤0.5占13.3%、0.5 ＜FIC ≤1 占66.7%、1 ＜FIC ≤4占20.0%；頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉聯用FIC 指數：FIC ≤0.5 占16.7%、0.5 ＜FIC ≤1 占83.3%；哌拉西林他唑巴坦聯用FIC 指數：FIC ≤0.5 占3.3%、0.5 ＜FIC ≤1 占90.0%、1 ＜FIC ≤4 占6.7%；亞胺培南西司他丁鈉聯用FIC 指數：FIC ≤0.5 占10.0%、0.5＜FIC≤1占80.0%、1＜FIC≤4占10.0%，見表5。

表5 痰熱清聯用四種抗菌藥物的 FIC 指數分布[n（%）]

3 討論

近年來，醫院ICU 感染CRAB 的主要原因是臨床濫用廣譜和碳青霉烯類抗生素，甚至威脅患者的生命安全[8]。鮑曼不動桿菌感染常采用聯合兩種或兩種以上抗生素進行治療[9]，但CRAB 已對所有抗菌藥物出現耐藥，所以頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉等藥物面臨治療困難[10]。體外實驗痰熱清10、20 mg/ml 作用于鮑氏不動桿菌后細菌的MIC 降低，有很好的抑菌效果[11]。目前，抗菌藥物很少對細菌的生物被膜有抑制作用，而中藥具有一定抑制作用[12]，有文獻報道中藥抗感染還有耐藥性低、多作用靶位廣譜抗菌效果、價格低廉等優點[13]。

本實驗結果顯示，痰熱清單獨用藥MIC 值范圍是1/4 ～1/2μl/ml，提示對CRAB 有較好的抑菌作用。當其分別聯合四種抗菌藥物后，各藥物的MIC 值范圍、MIC50 和MIC90 均有明顯的降低，痰熱清濃度最大降低8倍。選取痰熱清濃度1/4、1/8、1/16μl/ml聯合藥物抑菌，觀察菌株數變化，結果痰熱清1/4μl/ml 時，頭孢他啶64 μg/ml 抑菌菌株數最多是7 株；痰熱清1/8μg/ml 時，亞胺培南西司他丁鈉32 μg/ml 抑菌菌株數量最多為7 株，而頭孢他啶64 μg/ml 抑菌菌株數量分布最多14 株；痰熱清1/16μl/ml 時，頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉64 μg/ml 抑菌菌株數量最多13 株。通過觀察抑菌菌株數情況，發現痰熱清濃度最低1/16μl/ml 與頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉64 μg/ml 聯合應用效果顯著。計算藥物聯合抑菌FIC 指數結果顯示，痰熱清與頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉聯用協同作用為主，占16.7%；與哌拉西林鈉舒巴坦聯用相加作用突出，占90%；與頭孢他啶無關作用明顯，占20%；且痰熱清與頭孢他啶、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉舒巴坦鈉及亞胺培南西司他丁鈉聯用無拮抗作用。痰熱清與頭孢他啶聯用FIC 指數結果顯示雖有協同和相加作用，但其無關作用明顯，臨床應注意避免選擇此藥物治療。痰熱清與頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉聯用FIC 指數主要為相加（16.7%）和協同（83.3%）的作用，充分說明二者聯合應用具有良好的抑菌效果。該結論與馬冬梅等[14]的頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抑制泛耐藥鮑曼不動桿菌結論相一致。本研究痰熱清分別聯合四種抗菌藥物對CRAB的體外抑菌實驗，其中頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉和哌拉西林鈉他唑巴坦協同和相加作用好于頭孢他啶和亞胺培南西司他丁鈉，特別是頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉協同和相加作用最佳。臨床藥物聯合應用時要注意中藥與西藥配伍禁忌，避免不良反應的發生[15]。

綜上所述，痰熱清中藥注射液分別聯合四種抗菌藥物對CRAB 體外研究達到較好的預期抑菌效果，尤其與頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的協同和相加作用突出。中西藥聯用的抑菌機制原因可能是受抑制細菌細胞膜的某些組分、抑制生物被膜形成、阻止細菌外排泵外排抗生素等因素影響[16]，以此體外實驗研究作為基礎，今后更深入研究中西藥聯用的抑菌機制，爭取為臨床有效治療耐藥菌取得新的發現。