腦啡肽原(PENK-A)評估急性缺血性腦卒中嚴(yán)重程度 及預(yù)后的研究

鄭文雪

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

0 引言

腦啡肽，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的類嗎啡性神經(jīng)遞質(zhì)，與阿片受體結(jié)合，具有鎮(zhèn)痛，免疫調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等作用[1]。他們參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程，如帕金森病，阿爾茨海默病和嚴(yán)重的頭部損傷[2]。曾有研究表明急性腦梗死患者血漿甲硫氨酸腦啡肽水平升高[3]。因?yàn)榘⑵荏w激活在腦梗死中有無神經(jīng)保護(hù)作用都曾被報(bào)道過，所以腦啡肽在急性腦梗死中的作用尚不清楚[4,5]。腦啡肽原，以前稱為腦啡肽原A(因?yàn)槟X啡肽原B更名為為強(qiáng)啡肽原)，是內(nèi)源性阿片類多肽激素腦啡肽的前體，通過蛋白水解切割可以生成活性腦啡肽和蛋白水解片段。缺血性腦卒中是神經(jīng)內(nèi)科常見的一種疾病，占腦血管疾病的70%～80%，其致殘率及致死率均較高，嚴(yán)重威脅國民的身心健康和生活質(zhì)量。早期識(shí)別急診卒中單元中高危險(xiǎn)性的患者在臨床評估與決策中有重要意義，然而，與急性心肌梗死相比，目前缺少評估急性腦梗死嚴(yán)重程度及預(yù)后的有效標(biāo)志物[6-8]。既往所研究的關(guān)于急性腦梗死的標(biāo)志物可分為兩類，一類是梗死面積相關(guān)的標(biāo)志物(例如，星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白S-100B)，另一類是血腦屏障損傷相關(guān)的標(biāo)志物(例如c-Fn，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9))[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)PENK-A119-159片段是血腦屏障完整性的有效標(biāo)志物[10]，患者血漿中PENK-A 119-159片段含量與卒中嚴(yán)重程度，梗死面積大小，預(yù)后相關(guān)[11]。

1975年，Hans Kosterlitz等人報(bào)道了一種可以與嗎啡受體相互作用的內(nèi)源性嗎啡樣物質(zhì)，后來，他們提純了這種物質(zhì)并命名為腦啡肽[12]。腦啡肽是一種五肽神經(jīng)肽，由8號(hào)染色體上的PENK基因編碼的腦啡肽參與人體的各種生理過程[13]。在人體中，阿片受體主要有mu(MOR)，delta(DOR)，kappa(KOR)三種，受體合成主要發(fā)生在背根神經(jīng)節(jié)，并且通過軸突運(yùn)輸?shù)街袠屑巴庵苌窠?jīng)，其中與腦啡肽親和力最高的受體是DOR[14]。研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，DOR在大腦皮層，殼核，伏隔核，尾狀核，顳葉，海馬中高度表達(dá)，這種分布與DOR在運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知當(dāng)中的功能相關(guān)；在外周，DOR主要分布在腎上腺髓質(zhì)，心臟，胰腺，小腸，肺，腎，胸腺，許多的免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞中[15]。

前腦啡肽原A由267個(gè)氨基酸組成[16,17]，通過特異性信號(hào)肽酶去除N末端信號(hào)序列產(chǎn)生腦啡肽原A(PENK-A)前體蛋白(243aa)[18]，其在成對堿性氨基酸殘基處進(jìn)一步切割后產(chǎn)生活性腦啡肽[19]，即四個(gè)拷貝的甲硫氨酸腦啡肽，一個(gè)拷貝的亮氨酸腦啡肽，一個(gè)拷貝的甲硫氨酸腦啡肽-精氨酸甘氨酸亮氨酸，一個(gè)拷貝的甲硫氨酸腦啡肽-精氨酸苯丙氨酸和一個(gè)拷貝的enkelytin[20,21]。

甲硫氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽在體外是不穩(wěn)定的，在人血漿中的半衰期不到15分鐘[22]。而PENK-A 119-159具有抗降解作用，在體外室溫下有超過48小時(shí)的穩(wěn)定性，更適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室和臨床研究，被認(rèn)為是不穩(wěn)定腦啡肽的穩(wěn)定替代指標(biāo)[10,23]。盡管腦啡肽在人體中有很多功能，PENK-A 119-159作為前體PENK-A的連接肽在血液循環(huán)中可能是沒有功能的，目前沒有證據(jù)表明它在血液循環(huán)中與蛋白質(zhì)結(jié)合[23]。研究表明，腦脊液(CSF)中的PENK-A 119-159的量比循環(huán)中的高約100倍，是迄今為止?jié)舛忍荻茸罡叩腃SF蛋白質(zhì)[10]，因此它作為血腦屏障完整性的標(biāo)志物，與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 研究對象和分組

(1)病例組選取2016年至2019年以急性腦梗死為診斷收入盛京醫(yī)院第三神經(jīng)內(nèi)科病房的患者102人，對照組選擇同期以頭暈、椎基底動(dòng)脈供血不足、面神經(jīng)麻痹等為診斷住院治療的患者107人，磁共振未發(fā)現(xiàn)新發(fā)梗死病灶。

(2)病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》的診斷準(zhǔn)；2)急性起病，患者抽血時(shí)距離發(fā)病時(shí)間小于72小時(shí)；3)患者均行頭磁共振DWI證實(shí)新發(fā)梗死病灶。

病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：1)非血管性病因；2)影像學(xué)檢查示腦出血；3)可能影響血清PENK-A 水平的疾病：包括嚴(yán)重感染，膿毒血癥，心肌梗死，嚴(yán)重的肝腎疾病，嚴(yán)重心衰；4)臨床病例資料不完整。

1.2 資料的收集與樣本的檢測

1.2.1 一般病例資料的收集

患者入院后收集患者的一般情況：年齡、性別、吸煙史、飲酒史、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，病例組患者入院24小時(shí)內(nèi)按美國國立衛(wèi)生研究所腦卒中量表(NIHSS)評分評估患者出入院的神經(jīng)功能缺損程度。根據(jù)入院后頭磁共振DWI序列，用不規(guī)則物體體積公式計(jì)算梗死體積，根據(jù)梗死體積分組，梗死體積大于5cm3為大面積腦梗死組，小于等于梗死體積大于5cm3為其他腦梗死組。90天后對患者進(jìn)行電話隨訪，用改良Rankin量表(mRS)進(jìn)行行神經(jīng)功能評估，mRS評分≤2分者為預(yù)后良好組，mRS評分＞2分者為預(yù)后不良組。

1.2.2 樣本采集與檢測

血液樣本：EDTA作為抗凝劑，血樣抽取后立即將樣本離心，然后儲(chǔ)存至-80度冰箱直至分析。

PENK-A 119-159片段濃度的測量：應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測定血樣中PENK-A水平，試劑盒購買于上海酶聯(lián)生物公司，按照說明書規(guī)范測量。按說明書規(guī)范測量得樣本在450nm波長處的吸光度OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值計(jì)算出線性回歸方程，帶入樣品吸光度再乘稀釋倍數(shù)，獲得樣本濃度值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中PENK-A含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用R version 3.6.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)檢驗(yàn)正態(tài)性，若服從正態(tài)分布，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若不服從正態(tài)分布，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示，兩樣本均數(shù)的比較采用卡方檢驗(yàn)。病例組發(fā)病7天時(shí)和急性期PENK-A濃度的比較因不服從正態(tài)分布，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本情況

急性腦梗死病例組平均年齡(62.74±13.41)歲，其中男性65人。對照組平均年齡(61.42±12.18)歲，其中男性69人。兩組患者年齡服從正態(tài)分布，滿足方差齊性，在平均年齡，性別比例方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

表1 病例組和對照組基本情況

由上圖可見，病例組吸煙、高血壓病、糖尿病比例，糖化血紅蛋白、肌酐、同型半胱氨酸水平高于對照組，高密度脂蛋白水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，血漿PENK-A水平高于對照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，暫不能說明PENK-A水平升高與急性腦梗死發(fā)病相關(guān)。

2.2 病例組急性期和發(fā)病7天時(shí)血漿PENK-A濃度的比較

表2 病例組急性期和發(fā)病7天時(shí)血漿PENK-A濃度的比較

患者發(fā)病7天后血漿中PENK-A水平較急性期下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，暫不能說明兩者間存在差異。

2.3 血漿PENK-A水平與梗死體積的關(guān)系

利用不規(guī)則物體體積公式計(jì)算梗死體積，將梗死體積大于5cm3的樣本定義為大面積腦梗死，其中大面積腦梗死患者共31人，其他腦梗死患者71人。統(tǒng)計(jì)顯示，大面積腦梗死患者血漿PENK-A濃度大于其他腦梗死患者血漿PENK-A濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。使用Spearman相關(guān)性分析顯示，血漿中PENK-A濃度與梗死體積呈正相關(guān)(r=0.818，P＜0.001)。

表3 血漿PENK-A水平與梗死體積的關(guān)系

2.4 血漿PENK-A水平與臨床預(yù)后的關(guān)系

病例組90天電話回訪失訪4例，最終進(jìn)入隊(duì)列研究的患者共有98例，其中24例為預(yù)后不良組(24.49%)，74例為預(yù)后良好組(75.51%)，以mRS評分x小于等于2分為預(yù)后良好組，大于2分為預(yù)后不良組，兩組臨床資料比較見表3.4.1，可見預(yù)后不良組PENK-A水平明顯高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。將臨床預(yù)后與血漿PENK-A濃度進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸，顯示預(yù)后不良與高PENK-A濃度正相關(guān)(OR值：1.000851，95%可信區(qū)間CI：1.000339～1.001687，P=0.009)。

表4 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組臨床資料比較

表5 腦梗死預(yù)后logistic回歸分析

3 結(jié)論

3.1 急性腦梗死病例組血漿PENK-A濃度高于對照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，暫不能說明急性腦梗死患者PENK-A濃度升高。

3.2 發(fā)病7天后血漿中PENK-A水平較急性期下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，暫不能說明兩者間存在差異。

3.3 大面積腦梗死患者血漿PENK-A濃度高于其他腦梗死患者血漿PENK-A濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相關(guān)性分析顯示，血漿中PENK-A濃度與梗死體積呈正相關(guān)。

3.4 預(yù)后不良組PENK-A水平明顯高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；logistic回歸示預(yù)后不良與高PENK-A濃度正相關(guān)。

4 討論

通過急性腦梗死病例組與對照組臨床資料的對比發(fā)現(xiàn)，病例組吸煙、高血壓病、糖尿病比例，糖化血紅蛋白、肌酐、同型半胱氨酸水平高于對照組，高密度脂蛋白水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，病例組血漿PENK-A水平(925.9±1074.3 ng/mL)高于對照組(721.5±559.6 ng/mL)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.281)，結(jié)果與Doehner W等人研究不符[24]，他們通過研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死患者發(fā)病24小時(shí)內(nèi)血漿PENK-A濃度較對照組顯著升高，可能由于①本研究樣本量較小，其中小面積輕癥患者病例數(shù)較多，推測為小面積輕度腦梗血腦屏障破壞較輕，引起PENK-A水平變化不顯著導(dǎo)致。②因研究條件限制，本研究采集的是患者發(fā)病72小時(shí)內(nèi)的血液樣本，不排除濃度隨時(shí)間下降的影響。因此暫不能說明PENK-A水平升高與急性腦梗死發(fā)病相關(guān)。通過病例組發(fā)病急性期與發(fā)病7天時(shí)血漿PENK-A濃度的對比發(fā)現(xiàn)，病例組急性期PENK-A濃度(925.9±1074.3 ng/mL)高于發(fā)病7天時(shí)PENK-A濃度(897.3±957.1 ng/mL)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.712)，暫不能說明發(fā)病7天后血漿PENK-A濃度較急性期降低。進(jìn)一步研究考慮對血漿PENK-A水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，探尋血漿PENK-A濃度與發(fā)病時(shí)間的關(guān)系，以判別是否可以作為腦梗死急性期的標(biāo)志物。

通過對大面積腦梗死組樣本資料和其他腦梗死組樣本資料的對比發(fā)現(xiàn)，大面積腦梗死組患者血漿PENK-A濃度(1665.7±1568.7ng/mL)較其他面積腦梗死組(602.9±512.2ng/mL)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，用Spearman相關(guān)性分析顯示，血漿中PENK-A濃度與梗死體積呈正相關(guān)(r=0.818，P＜0.001)。研究發(fā)現(xiàn)，梗死體積大時(shí)，PENK-A濃度明顯升高，因此，PENK-A濃度可以作為評估腦梗死嚴(yán)重程度的標(biāo)志物。通過預(yù)后不良組與預(yù)后良好組臨床資料的對比，發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組血漿PENK-A濃度(1663.0±1785.0ng/mL)顯著高于預(yù)后良好 組(683.1±582.1ng/mL)，差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(P＜0.001)。logistic回歸示預(yù)后不良與高PENK-A濃度正相關(guān)(OR值：1.000851，95%可 信 區(qū) 間CI：1.000339～1.001687，P=0.009)。因此對PENK-A的研究可以為臨床工作提供指導(dǎo)，可以作為預(yù)測腦梗死預(yù)后的標(biāo)志物，但還需要更多的臨床實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

本研究尚存在一些不足之處，①因研究條件受限，病例組和對照組樣本均出自同一醫(yī)院，可能會(huì)存在選擇性偏倚。 ②因研究條件限制，本研究采集的是患者發(fā)病72小時(shí)內(nèi)的血液樣本，不排除濃度隨時(shí)間下降的影響；未能對PENK-A濃度進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，探尋血漿PENK-A濃度與發(fā)病時(shí)間的關(guān)系，以判別是否可以作為腦梗死急性期的標(biāo)志物。③未能去除心衰、感染等可能引起PENK-A濃度變化的混雜因素的影響。④病例組、對照組樣本量較小，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。