MiR-506-3p在腎透明細胞癌中作用的生物信息學分析

周凱，蘇琪盛，黎承楊

(廣西醫科大學第一附屬醫院 泌尿外科，廣西 南寧 530021)

0 引言

腎透明細胞癌是成年人最常見的一種腎臟腫瘤，是來源于腎臟泌尿小管上皮系統的一種惡性腫瘤，大概占到所有腎腫瘤的大約75%[1]。目前有大量研究表明，microRNA(miRNA)在腎透明細胞癌的發生發展中起著重要的作用[2-4]。

miR-506-3p腎透明細胞癌中低表達，其低表達與晚期臨床分期和預后不良有關，并通過直接靶向腎癌中的FLOT1發揮其抗癌功能[5]，然而miR-506-3p在腎透明細胞癌中的作用仍有待進一步探究。本文采用生物信息學手段，對miR-506-3p 在腎透明細胞癌中的作用進行探究，以期為后期深入研究miR-506-3p 在腎透明細胞癌中的作用及其機制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 Starbase工具分析miR-506-3p在腎透明細胞癌表達

Starbase v3.0是一款由Qu Lab. School of Life Science，Sun Yat-sen University開發的一個開源平臺，可以分析CLIP-seq、ome-seq和RNA-RNA間質數據研究miRNAncRNA、miRNA-mRNA、ncRNA-RNA、RBP-ncRNA和RBPmRNA相互作用[6]。我們通過starbase中的starBase Pan-Cancer Analysis Platform平臺工具分析TCGA數據庫中hasmiR-506-3p在腎透明細胞癌中的表達。

1.2 GEO2R分析腎透明細胞癌中上調的差異基因

在GEO數據庫GEO Dataset目錄下，檢索2013年1月1日至今，人類腎透明細胞癌組織及對照組織表達的數據集，設置檢索式為(("kidney"[MeSH Terms]OR Kidney[All Fields]) AND ("carcinoma，renal cell"[MeSH Terms]OR Renal Clear Cell Carcinoma[All Fields])) AND "Homo sapiens"[porgn]AND ("gse"[Filter]AND "Expression profiling by array"[Filter]AND "attribute name tissue"[Filter]AND ("2013/01/01"[PDAT]："2018/09/25"[P-DAT]))，結果再篩選能夠獲取注釋文件及平臺信息的數據集，納入GSE40435、[7]GSE53757、[8]GSE68417[9]三個數據集，使用GEO2R網絡在線工具對獲取的數據集進行差異基因分析，P＜0.05被認為具有統計學意義，將上調的差異基因用Venny 2.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.e-s/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖。

1.3 靶基因的預測及實驗驗證靶基因的查找

miRDIP數據庫[10]預測Minimum Score為very high且來源數據庫大于15個的靶基因。通過mirtarbase[11](更新于Sept. 15，2017)查找實驗驗證的靶基因，同時查閱文獻尋找2017年9月15日后發表文獻中涉及到的miR-506-3p靶基因，以上三者的并集被納入作為靶基因集合，將差異基因與靶基因集合取交集作為候選靶基因進行下一步分析。

1.4 構建蛋白互作網絡

將上述的到的候選靶基因導入networkanalyst[12](http：//www.networkan-alyst.ca/face-s/home.xhtml)構建miR-506-3p靶基因編碼蛋白質互作用網絡。

2 結果

2.1 miR-506-3p在腎透明細胞癌表達

starbase中的starBase Pan-Cancer Analysis Platform中，來自TCGA的miRNA seq表達數據通過log2(RPM + 0.01)表示并繪得箱型圖(圖1)，miR-506-3p在正常樣本中(71例)的表達高于腎透明細胞癌樣本(517例)(P=1.6×10-61)。

圖1 miR-506-3p在腎透明細胞癌表達下調

2.2 GEO2R獲取上調的透明細胞癌差異基因

經過GEO2R工具，GSE40435篩得17892個差異表達基因，其中上調基因7363個下調基因10529個、GSE53757篩得28021個差異表達基因其中上調基因7855個，下調基因20166個、GSE68417篩得10157個差異基因，其中上調基因4892個，下調基因5265個。三個數據集曬出的上調差異基因取交集共得到2975個在三者均為上調的差異基因。

2.3 靶基因預測結果及實驗驗證靶基因

miRDIP預測到靶基因共計Minimum Score為very high、來源數據庫大于等于15個的靶基因共計 431個，Mirtarbase數據庫查找到FXN、SNAI2、CD151、VIM、CDK4、CDK6六個基因為擁有強證據熒光素酶報告實驗、westen blot、qPCR)支持的靶基因。經查閱文獻，FLOT1、[5]IL8、[13]NEK6、[14]JAG1、[15]RAB3D、[16]STAT3、[17]BECN1、[18]CREB1、[19]KLF4、[20]KLF5[20]亦被納入作為候選靶基因。以上三者的并集共計442個基因作為靶基因集合(圖3.左)，與差異上調基因取交集得到116個候選靶基因(圖3.右)。

圖2 三個數據集上調差異基因的交集

圖3 靶基因交集（左）和候選靶基因（右）

2.4 蛋白互作網絡

Networkanalyst繪制的蛋白互作網絡，圖中顯示hasmiR-506-3p的靶基因編碼的蛋白間有著復雜的互相作用關系(圖4)，互作數量排名前十的基因為：UBC、SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ELAVL1、ETS1、BCL6、IQGAP1、APP。其 中SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ETS1、BCL6、IQGAP1七個基因為前文得到的hsa-miR-506-3p在腎透明細胞癌中作用的候選靶基因。

3 討論

MicroRNA (miRNA) 是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在真核基因轉錄后表達調控中有著廣泛的作用。miRNA參與到了幾乎所有生物過程中，異常的miRNA表達通常與癌癥有關。自2002年，Calin等發現miR-15 and miR-16在慢性淋巴細胞白血病中頻繁缺失和下調以來[21]，越來越多的研究發現miRNA可以發揮癌基因或抑癌基因作用，在腫瘤發生、發展、預后中扮演十分重要的角色。

miR-506-3p在多種腫瘤中下調，作為一種抑癌基因被研究，并通過靶向調控多個基因在腫瘤中發揮作用。目前的研究發現，miR-506-3p。在某些情況下miR-506-3p亦可在腫瘤中發揮不同的作用，如黑色素瘤中其作為癌基因存在[22]，在羥基喜樹堿(HCPT)抗性人結腸癌細胞中過表達等[23]。

本文通過生物信息學的手段，對miR-506-3p在腎透明細胞癌中的作用進行了初步的探究，starBase Pan-Cancer Analysis Platform的結果顯示，miR-506-3p在腎透明細胞癌中較正常組織低下調，這與現有關于miR-506-3p在腎透明細胞癌中的研究相同，故本文認為其在腎透明細胞癌中下調是可信的。

圖4 蛋白互作網絡

本文研究得到SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ETS1、BCL6、IQGAP1七個可能的miR-506-3p在腎透明細胞癌的中發揮作用的靶基因。此七個基因在腫瘤中的發生發展均得到了廣泛研究，除IQGAP1外，其余基因在腎透明細胞癌中的作用都有報道[19,24-27]。值得一提的是，有文獻報道SP1在pVHL抑制轉錄中起著關鍵作用[28]。本次研究發現miR-506-3p有可能通過作用于SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ETS1、BCL6、IQGAP1從而參與到腎透明細胞癌的發生發展中。但由于缺乏實驗數據支持，本研究的結論仍有待進一步驗證以探索其在腎透明細胞癌中的機制，以及其在診斷和分子治療中的應用。