缺氧環境對新生SD大鼠神經干細胞增殖的影響及與miR-124-3p的相關性研究

林超群 范學政 邱波

【關鍵詞】神經干細胞;缺氧環境;增殖;miR-124-3p

各國科學家于上世紀90年代開始了神經干細胞（NSCs）的深入研究，研究人員對哺乳動物腦組織進行細胞群落篩選，發現了一個不僅可以不斷分裂，還具有多分化潛能的細胞群落，把它命名為NSCs。腦缺血缺氧往往會導致NSCs的細胞活力受到抑制，甚至發生凋亡，而且NSCs對缺氧環境非常敏感，缺氧環境中NSCs非常容易發生延遲死亡。研究者發現在腦缺血缺氧大鼠模型中，NSCs可依然促進大鼠神經功能的恢復，但缺氧環境中，NSCs的神經修復功能是否削弱，國內外學者并未深入研究。近20年來的研究表明NSCs增殖能力可受到miRNA的調控，目前miRNA與NSCs功能的相關性研究正在逐步深入，其中miR-124-3p被證明與NSCs增殖關系密切，miR-124-3p的高表達可靶向抑制Delta-like1（DLL1）蛋白表達，促進NSCs的增殖。但缺氧環境中，miR-124-3p與NSCs的相關性研究，國內外文獻尚未報道。本研究建立缺氧NSCs模型及無缺氧NSCs模型，比較兩組模型NSCs的增殖能力，并且分析miR-124-3p與NSCs的相關性，為缺氧環境中NSCs增殖的機制提供理論基礎本研究建立缺氧NSCs模型及無缺氧NSCs模型，比較兩組模型NSCs的增殖能力，并且分析miR-124-3p與NSCs的相關性，為缺氧環境中NSCs增殖的機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

培養基 DMEM/F12為1∶1，B27細胞補充添加劑、表皮生長因子（EGF）重組鼠源表皮生長因子及胰蛋白酶消化液來自于Gibco 公司（美國），重組鼠源堿性纖維細胞生長因素青霉素-鏈霉素雙抗溶液來自于PeproTech公司（美國），Accutase分離液，美國Sigma-Aldrich公司、多聚賴氨酸PDL，美國Sigma-Aldrich 公司、PBS 磷酸緩沖鹽溶液（pH7.2），美國Thermo Scientific公司、多聚甲醇，國藥集團化學試劑有限公司、曲拉通Triton X-100來自于美國Amresco公司，小鼠抗兔多克隆抗體和兔抗小鼠IgG H&L采用美國Abcam公司、驢血清來自于美國Jackson 公司;4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液來自于雷根生物技術有限公司（北京）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒來自于凱基生物科技發展有限公司（南京）、RNA提取試劑盒，美國Invitrogen公司。 三氣培養箱，Thermo Scientific公司;二氧化碳培養箱，美國Thermo公司;倒置熒光顯微鏡，日本Nikon 公司;激光共聚焦顯微鏡，美國OLYMPUS公司。

1.2 方法

（1）原代NSCs的提取培養（胎鼠海馬來源）。實驗使用雌性大鼠為：孕14天SD大鼠，所有大鼠均來源于維通利華實驗動物技術有限公司（北京）。使用頸部脫臼的方法，結束孕14天SD大鼠的生命，在無菌操作臺，0 ℃環境中腹部解剖實驗大鼠，取出胎鼠，逐步分離出胎鼠的大腦，顯微鏡下解剖出胎鼠海馬組織，顯微剪均勻海馬組織加入胰酶（0.25%）進行5分鐘的消化處理，再給予胎牛血清（10%）對消化過程進行終止，給予5分鐘的800r離心處理，棄上清液，加入NSCs完全培養后，仔細吹打均勻重懸，過400目細胞篩網，細胞計數后，接種于細胞培養瓶中，把細胞密度調整為5×105/mL。在溫度37℃，二氧化碳濃度為5%的恒溫培養箱中培養，3 天換液，7 天傳代，每天在顯微鏡下觀察NSCs的狀態，取第2代懸浮NSCs球進行下一步實驗。

（2）NSCs免疫熒光鑒定。使用濃度為100 μg/mL的多聚賴氨酸預先包被24 孔板爬片，PBS 輕柔沖洗3次，取吹打均勻的第2代懸浮NSCs 200 μL放置在24孔爬片上，在恒溫箱內培養120 min，在細胞出現貼壁反應后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 輕柔沖洗3 次;加入0.3%曲拉通Triton X-100通透30 min，給予PBS實施3次的輕柔沖洗，給予驢血清（10%）實施一小時的37 ℃的封閉處理，不給予清洗操作，給予一抗（小鼠抗兔多克隆抗體Nestin），4度孵育過夜;PBS輕柔沖洗3次;在避光環境下加入同源熒光二抗（兔抗小鼠IgG H&L）在室溫下一小時的孵育處理，給予PBS反復3次沖洗操作;給予DAPI染核處理，再實施PBS反復3次沖洗操作，將爬片處理后放置在脫載玻片進行封片處理，用熒光顯微鏡對染色結果進行觀察分析。

（3）CCK8試驗。用Accutase分離液消化第2代懸浮NSCs球，消化充分后細胞球消失，形成多個懸浮單個細胞，對細胞濃度進行調整，在96孔內實施1×104個/孔密度的細胞設置，我們建立缺氧NSCs模型及無缺氧模型，缺氧模型為37度，50%空氣，45%N2，5%CO2，的細胞培養環境。無缺氧模型為37度，5%CO2，95%空氣的細胞培養環境。我們將NSCs分為無缺氧組，缺氧組，兩組不同細胞分別接種于96孔板，無缺氧組在無缺氧環境中培養72小時。缺氧組在缺氧環境中培養72小時，然后每個孔給予10 μLCCK8 試劑的加入，并實施兩小時的37 ℃溫度下的孵育處理，對450 nm波長各孔的吸光度水平實施酶標儀的檢測處理，記錄數據并統計。

（4）不同缺氧環境中NSCs增殖的形態學鑒定。為了研究缺氧環境中NSCs的增殖能力，取第2代懸浮NSCs，細胞計數后，接種于細胞培養瓶中，把細胞密度調整為5×105/mL。將NSCs分為無缺氧組和缺氧組，兩組不同細胞在不同缺氧環境中培養，72小時后在顯微鏡下觀察NSCs的狀態。

（5）RT-PCR檢測miR-124-3p的表達水平為了檢測2組不同細胞miR-124-3p的表達水平，我們收集無缺氧組及缺氧組細胞后，使用Trizol法提取RNA，以37度持續60 分鐘，85 度持續5分鐘進行反轉錄反應;然后95度預變性10 分鐘;95度變性20秒;60度退火15秒，72度延伸收集30秒，一共40個擴增循環。每個樣本設置3個復孔，采用2-ΔΔCt 法計算miR-124-3p基因的相對表達量，該實驗重復3 次并取其均值。

1.3 統計學分析

以上各項指標給予（x—±s）進行表示，開展GraphPad8.0軟件及SPSS 22.0軟件對符合方差齊性及正態分布的數據資料實施t檢驗的處理，當P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 原代胎鼠海馬來源NSCs形態及鑒定

NSCs懸浮生長，隨著增殖的NSCs逐漸融合，6～7天后，肉眼就能辨認出含有數千個細胞的大神經球（圖A1～A2）。原代NSCs在體外是神經球樣的，通過免疫熒光法證實表達NSCs的特異性標記蛋白Nestin（圖B1～B2）。

2.2 不同缺氧環境對NSCs活力的影響

本研究采用CCKB實驗評估顯示，在缺氧環境中，NSCs的細胞活力明顯下降（P<0.01），見圖2。

2.3 兩種不同缺氧環境中原代NSCs增殖培養的形態

實驗分組后，72 h后在顯微鏡下觀察NSCs的狀態：無缺氧組見大多數細胞顯著增殖呈懸浮聚集成球生長，只有少數細胞呈單個細胞生長。缺氧組少部分細胞成球生長，大部分仍呈單細胞生長，見圖3。

2.4 缺氧環境中NSCs的miR-124-3p的表達水平

實驗分組后，72 h后使用RT-PCR實驗檢測兩組不同細胞miR-124-3p的表達水平。通過實驗發現，在缺氧環境中，miR-124-3p的表達量明顯下降，見圖4。

3 討論

本研究的目的是探討缺氧環境對新生SD大鼠NSCs增殖的影響，并且分析miR-124-3p與NSCs的相關性，為缺氧環境中NSCs增殖的機制提供理論基礎[1-2]。本研究結果表明，在缺氧環境中，新生SD大鼠NSCs增殖受到明顯抑制[3]，并且NSCs中miR-124-3p的表達量高低與不同缺氧環境具有相關性[4]。

自從1992年Reynolds首次提出NSCs的概念后，通過NSCs治療神經系統疾病，給腦損傷后神經功能的恢復帶來了新希望。miR-124-3p作為中樞神經系統特異性的miRNA，在NSC 的增殖與向神經性分化過程中，起著關鍵性的作用[5]。研究證明，miR-124-3p的高表達可靶向抑制Delta-like1（DLL1）蛋白表達，促進NSCs的增殖，在NSC 的維持與神經再生中起關鍵作用[6].。在本研究中，我們建立缺氧NSCs模型的建立，證實了缺氧環境對NSCs增殖的影響非常大，同時也明確了miR-124-3p的表達量與缺氧環境的相關性，但miR-124-3p具體通過何種通路，在缺氧環境中調控NSCs的增殖機制研究，本研究并未明確，需要進一步研究來揭示這一機制。本研究有一定的局限性。由于本研究是在體外進行的，因此在體內缺氧環境中進一步NSCs的增殖機制仍有必要[7-8]。

綜上所述，在缺氧環境中，新生SD大鼠NSCs增殖受到明顯抑制;NSCs中miR-124-3p的表達量高低與不同的缺氧環境具有相關性。